This work was supported by NIH grant GM50936 to DKB.

참고 : 프로토콜의 일부 단계 아래 깨끗한 흄 후드에서 작업이 필요합니다. 또한, 상기 방법은 spheroplasting을 모니터링 10X 작동 거리가 긴 대물 렌즈를 구비 한 효모 테트라 해부 현미경을 필요로한다. 현미경은 미리 후드에 설치해야합니다. 범위에서 미세 조작기의 팔과 판 홀더를 제거하고 멀리 작업 영역에서 안전한 장소에 이러한 항목을 배치합니다. Spheroplasts 1. 준비 <ol><li> 원하는 조건 하에서 효모 성장. OD600 = 1.4 5 × 107 세포 / ㎖에서 각각의 샘플에 대해 2 × 108 세포, 즉 배양 4㎖를 사용. 샘플의 즉각적인 처리가 어떤 경우에는 바람직 할 수 있지만, 대부분의 애플리케이션에 대해, 세포 분취 액 처리되기 전 최대 8 시간 동안 얼음 상에 저장 될 수있다. </li><li> 세포 펠렛 3 분 5 (2345 RPM / 857.5 XG)를 설정에서 임상 원심 분리기에 15 ml의 원심 분리기 튜브와 스핀에 세포 현탁액을 전송합니다. </lI&gt; <li> 펠렛에서 세포를 잃지 않도록 매체 복용 치료를 가만히 따르다. 부드럽게 1 ML의 ZK 버퍼에있는 세포를 재현 탁하고 40 μL 1 M 디티 오 트레이 톨 (DTT)를 추가합니다. 부드러운 혼합 2 분을 품어. 세포 펠렛은 이전처럼 (단계 1.2 참조). </li><li> 1 ML의 ZK 버퍼에 재현 탁 펠렛. 완전히 혼합 된 zymolyase 100T의 새로 제조 액 5 μl를 추가합니다. 세포벽을 제거한 spheroplasts을 제조 30 ℃에서 20-30 분 동안 인큐베이션. </li><li> spheroplasting가 완료되었는지를 결정하기 위해 현미경 슬라이드에 세포 현탁액 10 μL 액적 분석. 커버 슬립없이 해부 현미경으로 본 세포. 세포가 부풀어 둥근보다는 약간 타원형 표시해야하며, 물 20 ㎕를 첨가 한 다음 용균한다. 세포 용균하지 않으면 물에 의한 분해가 쉽게 관찰 될 때까지 매 10 분, 30 ℃로 샘플을 반환하고 다시 분석. 세포 펠렛은 이전처럼 (단계 1.2 참조). </li><li> 부드럽게 재현 탁 세포 펠렛 내가 씻어N 2.5 ml의 차가운 MES / 소르비톨 버퍼입니다. 세포 펠렛은 이전처럼 (단계 1.2 참조). 부드럽게 300-400 μL 감기 MES / 소르비톨 버퍼에 세포 펠렛을 재현 탁. 세포를 수 시간 동안이 단계에서 얼음에 보관 될 수있다. </li></ol> 확산 2. 염색체 참고 : 염색체 - 확산 중 슬라이드 나 될 때 유리 표면 된 커버는-한다 미리 준비하십시오. 각 슬라이드 또는 커버 슬립이 물에 잠긴해야하고 EtOH로는, 다음 건조시키고, 렌즈 페이퍼로 연마. 염색체가 된 커버에 확산 될 경우, 커버 슬립은 스카치 테이프 나 고무 시멘트와 슬라이드에 부착해야한다. 특별히 언급하지 않는 한, 프로토콜의 나머지 부분은 하나의 슬라이드 나 커버 슬립 확산 설명한다 <ol><li> 깨끗한 슬라이드의 표면에 P20의 피펫, 피펫 세포 현탁액 20 μL를 사용. </li><li> P200에 피펫을 사용하여, 3 % PFA / 수크로오스 용액 40 μL를 추가하고 부드럽게 혼합 solutio슐 리렌 라인이 사라질 때까지 손으로 슬라이드를 &quot;소용돌이&quot;에 의해 N. 현미경 슬라이드를 놓고 세포에 초점이 있음을 확인합니다. PFA 솔루션은 사용 당일 흄 후드에서 갓 준비를해야합니다. 주 : 관심의 단백질이 이전의 방법에 의해 조사되지 않은 경우, 그 단백질의 보존이 정착 조건에 민감인지 확인 (2) 및 4 % PFA를 포함하는 용액을 사용하여 추가 슬라이드를 준비하는 것이 바람직하다. 4 % PFA / 수크로오스 용액은 미세 소관 연관 튜 불린을 시각화 바람직한 경우에 사용된다. 높은 정착 농도의 단점은 염색체가 될 것입니다 &quot;underspread,&quot;2 % PFA는 &quot;underspread&quot;염색체를 생성하는 경향이있다. </li><li> P200의 피펫을 사용하여, 완전히 가능한 한 솔루션을 혼합하기 전에 소용돌이, 타이머를 시작, 1 % Lipsol의 80 μl를 추가합니다. Lipsol를 사용할 수없는 경우, 80 μL 1 % NP40 80 μL의 DH 2 O가 될 수있다(그림 2를 대표 결과를 참조) 교체. </li><li> 슬라이드마다 15 초 소용돌이 조심스럽게 부드럽게 세포를보십시오. 세포의 약 80 %가 용해되면, 즉시 현미경에서 슬라이드를 제거, 타이머를 중지 PFA / 자당 용액 80 μl를 추가하고, 소용돌이 혼합 (사라). 용해는 타이머를 시작한 후 30 사이에 90 초에서 발생한다. 주 : 여러 슬라이드 거의 동시에 용해를 보여 주면, 하나 결국 슬라이드의 나머지 현미경 모니터링을 생략하고 단순히 신중 lipsol 및 고착성의 최종 분취 량의 첨가의 첨가 기간을 사이에 시간이있다. 동일한 샘플에서 여러 슬라이드를 준비 할 때 그러나,이 지름길은 신뢰할 수있다. 다른 슬라이드가 서로 다른 시간에 촬영 한 샘플이나 다른 문화에서 준비 때 현미경으로 각 샘플의 용해를 모니터링하는 것이 가장 좋습니다. </li><li> 깨끗하고 평평한 표면에 슬라이드를 삽입하고 전체 unfrosted SURFAC에 걸쳐 액체를 확산「웅덩이」의 메 니스 커스 아래에 있지만, 즉 슬라이드 자체의 표면 위에 유지 깨끗한 목장 일회용 피펫의 측면을 사용하여 슬라이드의 전자. 피펫과 슬라이드의 표면을 &quot;긁어&quot;하지 않습니다. 샘플의 오염을 방지하기 위해 다른 슬라이드에 피펫을 재사용하지 마십시오. </li><li> 흄 후드에서 하룻밤 건조 슬라이드를 남겨주세요. 불용 성분은 핵 슬라이드 표면에 정착하고 결합한다. 많은 실험에서, 건조 단계를위한 공간의 사용을 계획하는 것이 중요하다. </li><li> 건조 후에, 최적의 결과는 같은 날 면역 단계로 진행하여 획득된다. 그러나, 건조 수크로오스 용액을 동결 샘플을 허용 &quot;꿀&quot;의 확산 염색체를 내장 : 슬라이드는 슬라이드 플라스틱 상자로 옮기고 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol> 3. 면역 염색 <ol><li> 30 초 동안 0.2 % 사진 - 플로의 딥​​ 슬라이드. 꿀을 제거합니다. 에 린 슬라이드모서리, 가장자리는 종이 타월에 쉬고, 잔류 포토 플로를 제거합니다. </li><li> 5 분 1X TBS에서 딥 슬라이드 씻어. 가장자리에 슬라이드를 기대어으로 물기를 제거하지만, 그들을 건조하게하지 않습니다. </li><li> 면을 위로, 피펫 300 μL TBS / BSA 슬라이드의 unfrosted 부분에서 슬라이드에 프로스트 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 15 분 동안 실온에서 습기 챔버에 품어. (포화 종이 타월로 천공 된 금속판 또는 플라스틱 슬라이드 상자에서 물 포화 종이 타올 늘어서 대형 플라스틱 용기). </li><li> 종이 타월에 슬라이드의 짧은 가장자리 휴식 (예 : 테스트 튜브 랙 등) 적절한 지원에 대한 슬라이드를 기대어으로 슬라이드를 배출합니다. 표면이 건조하지 않도록하십시오. </li><li> 즉시 차 항체의 적절한 희석을 포함하는 TBS / BSA 버퍼의 80 μl를 적용합니다. 항체가 제한되어있는 경우, 40 μL와 22 X 22mm의 coverslip에 사용합니다. 조 토끼 혈청의 경우, 이는 전형적으로 1/50 1/500 희석 사이이다. 노트:새로운 항체 제제에 적정을 수행합니다. 배경 위의 높은 신호를 산출 가장 묽은 준비가 선택됩니다. 사전 면역 혈청으로 염색해야한다 배경 염색의 레벨에 맞는 제어하기 위해, 핵은 해당 삭제 돌연변이 균주 및 / 또는 중복 슬라이드에서 준비를해야합니다. </li><li> 거품을 피하는 슬라이드에 광택 22 X 50mm의 coverslip에 배치합니다. 하나의 짧은 가장자리 근처에 위치에 긴 가장자리를 따라 엄지 손가락과 검지 손가락 사이의 커버 슬립을 개최하여이 작업을 수행합니다. 30 °의 각도로 커버 슬립을 잡고 그냥 &quot;웅덩이&quot;슬라이드의 프로스트 지역에 가장 가까운 가장자리 안쪽 슬라이드에 닿을 때까지 손가락의 짧은 가장자리 먼이 저하되고, 슬라이드. 그런 다음 천천히 슬라이드 터치 벤치를 잡고 손가락까지 부드러운 동작으로 커버 슬립을 절감하고 놓습니다. 이 땅을 한 번 커버 슬립의 위치를​​ 조정하지 마십시오. 참고 : 염색체 스프레드가 준비 되었다면부착 된 커버 (보다는 직접에 슬라이드의 표면),이 샘플 커버 슬립은 염색 및 세척 단계에 걸쳐 슬라이드에 부착 된 상태로 유지됩니다. 추가 커버 슬립은 염색 후 폐기시 균일 항체 용액을 분배하는 샘플 커버 슬립 위에 배치 될 것이다. </li><li> 밀봉 된 습기 챔버에 넣어 슬라이드 및 4 ℃에서 밤새 품어. </li><li> 유리 슬라이드 염색 랙에 프로스트 에지 전송에게 슬라이드를 잡고 TBS를 포함하는 염색 항아리에 잠수함. </li><li> 부드럽게 커버 슬립을 제거하기 위해 위 아래로 슬라이드를 찍어. 이 작업을 수행하기 위해 너무 많은 힘을 사용하지 않도록하십시오. TBS에서 침수에 의해 10 분 2 배 슬라이드를 씻으십시오. 랙에서 슬라이드를 제거하고 종이 타월에 가장자리를 터치하여 초과 액체를 배출. 표면 건조하게하지 마십시오. </li><li> 부드러운 조명 아래에서 작업을 즉시 80 μL TBS / BSA는 형광 색소 결합 된 이차 항체 (또는 22 X 22mm의 coverslip에 40 μL)의 1 / 1,000 배 희석액을 포함하는 추가합니다. 광고그리고 이전과 개발 커버 슬립은 어둠 속에서 습한 챔버에서 2 시간 동안 4 ° C에서 품어. </li><li> 이전으로 된 커버를 제거 슬라이드를 배출하고, 어둠 속에서 1 ~ 2 시간 동안 자연 건조에 표면을 할 수 있습니다. 이전과 종이 타월에 엎드려서 슬라이드. 참고 : 확산하는 것은 장착 커버 슬립에 수행 된 경우, 건조하기 전에 슬라이드에서 커버 슬립을 분리합니다. 이전 단계에서 설명한 바와 같이 슬라이드의 커버 슬립을 건조한다. </li><li> 부드러운 조명 아래에서 작업, DAPI (세 10 μL 방울)를 포함하는 매체를 장착 약 30 μl를 추가 한 다음 조심스럽게 커버 슬립을 낮 춥니 다. 스프레드가 된 커버에있는 경우, 깨끗한 슬라이드에 장착 매체의 방울을 배치하고 슬라이드에, 아래로 커버 슬립, 염색체 측을 내립니다. </li><li> 여전히 부드러운 조명 아래, 정착 분명 매니큐어와 커버 슬립의 가장자리를 밀봉 coverslip에 대한 2 분을 기다립니다. 평면 슬라이드 상자에 슬라이드를 놓습니다. 참고 : STED 현미경, 연장 금으로 마운트합니다. 연장 금의 30 μl를 사용하여및 DAPI없이 하룻밤 치료 할 수 있습니다. 매니큐어로 밀봉하는 것은 불필요하다. </li><li> 40 100X 목적은 DAPI가 초점을위한 적절한 설정 필터를 사용하여와 위드 표면 형광 현미경으로보기 슬라이드. 선택적으로 몇 주 동안 4 ° C에서 어둠 속에서 슬라이드를 저장합니다. 냉동하지 마십시오. </li></ol>

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	<li>Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+synapsis+in+a+haploid+yeast.">Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast.</a> Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).</li><li>Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+morphological+approaches+for+the+analysis+of+meiotic+chromosomes+in+yeast.">Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast.</a> Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).</li><li>Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meiotic+recombination+checkpoint+controlled+by+mitotic+checkpoint+genes.">A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes.</a> Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).</li><li>Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecA+homologs+Dmc1+and+Rad51+interact+to+form+multiple+nuclear+complexes+prior+to+meiotic+chromosome+synapsis.">RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 79, 1081-1092 (1994).</li><li>Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+identifies+Monopolin:+a+kinetochore+protein+required+for+segregation+of+homologs+during+meiosis+I.">Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I.</a> Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).</li><li>Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+RecA-like+recombinases:+Distinct+roles+for+mediator+proteins+in+mitosis+and+meiosis.">Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis.</a> PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).</li><li>Biggins, S., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+budding+yeast+protein+kinase+Ipl1/Aurora+allows+the+absence+of+tension+to+activate+the+spindle+checkpoint.">The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint.</a> Genes &amp; Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).</li><li>Dresser, M. E., Giroux, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+behavior+in+spread+preparations+of+yeast.">Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast.</a> The Journal of Cell Biology. , (1988).</li><li>Lao, J. P., Cloud, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+crossover+control+by+concerted+action+of+Rad51-Dmc1+in+homolog+template+bias+and+robust+homeostatic+regulation.">Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation.</a> PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).</li><li>Vonesch, C., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+thresholded+landweber+algorithm+for+wavelet-regularized+multidimensional+deconvolution.+IEEE+transactions+on+image+processing+:+a+publication+of+the.">A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the.</a> IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

The appearance of spread nuclei critically depends upon the balance between fixation and lysis/detergent treatment. As discussed above, the preservation of varying cellular structures requires the use of different PFA concentrations. For most proteins, 3% PFA is optimal. However, preservation of spindles requires use of 4% PFA. Even with a single set of reagents, the timing of lysis relative to fixation can also affect the quality of spread nuclei. For the most consistent results, the time of lysis should be normalize...

출아 효모 사카로 마이 세스 세레 비지 염색체 기능을 조절하는 단백질에 대한 연구를 포함한 생물학적 과정의 분자 메커니즘의 연구에 많은 이점을 제공한다. 유전 적 분자 및 생화학 적 연구를위한 효모 신진의 공지의 장점이 있지만, 세포의 핵 단백질의 분포의 세포 학적 연구는 작은 크기에 의해 복잡하게된다. 전형적인 효모 핵은 가시광의 단지 약 5 배의 해상도 한계 미만 1 미크론의 직경을 갖는다. 따라서, 종래의 면역 염색에서 또는 녹색 형광 단백질 (GFP)과 같은 형광 단백질 태그를 사용함으로써 얻어 질 수 핵 단백질의 분포에 대한 정보의 양이 제한된다. 단백질 subnuclear 분포를 특성화하는 유용한 방법은 확산 염색체 표면이다. 이 접근법은, 세포벽을 제거하고 세포 핵막 및 중단을 포함llowing 핵의 불용 내용 현미경 슬라이드의 표면에 정착한다. 이 불용성 성분은 핵 매트릭스와 염색체를 포함한다. 염색질 결합 단백질을 감지하는 능력을 향상 가용성 핵 콘텐츠의 삭제를 가능하게하는 것 외에도, 이러한 확산 핵 주위이 3 μm 내지 5의 직경을 가지고 (이배체 감수 핵 대) 염색체의 실질적인 신장에있어서의 결과를 확산 염색체 2 배체 유사 분열 핵에 대한 μm의 3. 이 압축 해제는 그대로 핵에 해결할 상대적으로 어렵거나 불가능 핵 하부의 검출 할 수있다. 확산 염색체 명백한 단점은 확산 과정은 관심의 구조를 부분적으로 또는 완전히 중단 할 가능성이다. 특히 관심의 특정 염색체 결합 단백질 확산 과정의 결과로서 손실 될 수 있다는 것이다. 이 잠재적 인 합병증 수오데이터를 해석 할 때, LD는 명심. 확산 과정에 민감한 단백질의 하나의 예는 베타 - 튜 불린이다. 일부 조건 하에서, 주로 튜 불린 구성되는 스핀들, 3, 확산 중에 보존된다. 스핀들의 시각화는 종종 관심의 핵를 준비하는 데 유용합니다. 그러나, 튜 불린을 떠올리 고농도 정착액 치료를 필요로; 스핀들은 후술하는 표준 조건 하에서 손실된다. 이 예는 이전에 규명하지 않은 단백질의 분포를 분석 할 때, 그 단백질이 이러한 변화에 얼마나 민감한 결정 정착액의 농도를 변화시키는 것이 중요하다는 것을 나타낸다. 염색체 구조에 확산 조건의 영향에 대한 우려에도 불구하고, 확산 방법의 유용성 및 전원은 많은 콘텍스트에서 설명과 유사 분열의 특성화 및, 특히 4-7 감수 세포에 다양한 유틸리티가되었다. TWO 확산 방법이 널리 사용되어왔다. 드레서 및 지로 (8)에 의해 개발 된이 방법의 첫 번째, 세제의 사용을 회피하고, DNA 특이 적 염색을 위해 DAPI 염색 때 비교적 잘 보존 염색체 형태를 갖도록 표시 확산 제제를 수득 할 수있다. 그러나,이 방법은 완전 비교적 어렵고 하나의 슬라이드 영역이 다른 영역에 비교 될 때 확산 핵의 품질은 크게 달라진다. 이 문제는 데이터 수집 바이어스를 피하기 위해 하나의 슬라이드에서 다수의 선택되지 않은 핵 촬상 포함 정량적 방법을 복잡하게 할 수있다. Loidl과 클라인 (1)에 의해 개발 된 방법을 확산 번째 염색체는, 용해 및 세제에 의해 추진 염색질 압축 해제와 함께, 파라 포름 알데히드로 고정 균형을 포함한다. 제대로 수행되면,이 방법은 드레서와 지로 방법에 비해 적은 지역 간 지역 변화에 매우 재현 가능한 결과를 제공합니다. 이 프레젠테이션은 변형 된에 초점을 맞추고때문에 그것의 신뢰성과 단순성의 Loidl과 클라인의 방법의 D 버전. 염색체 확산은 복잡하거나 시간 소모적 아니다; 최대 100 슬라이드는 하루에 대한 면역 염색을 제조 할 수있다. 또한, 확산 제로는 종래 면역 년 동안 냉장고에 저장 될 수 있고, 이에 따라 랩 새로운 생물학적 질문이 발생하거나 새로운 염색 시약이 제공 될 때 사용할 수있는 냉동 염색체 스프레드 저장소를 개발할 수있다. 염색체 확산 방법이 가장 일반적으로 면역 염색과 위드 형광 현미경과 조합하여 사용되지만, 그와 같은 유도 방출 고갈 (STED) 현미경 등의 수퍼 - 해상도 광 현미경 방법을위한 슬라이드를 제조하는 것도 가능하다.

<table><tbody><tr><td>Zymolyase</td><td>US Biological&amp;nbsp;</td><td>Z1004</td><td>Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4&amp;deg;C until ready for use.</td></tr><tr><td>Lipsol&amp;nbsp;</td><td>L.I.P. Ltd&amp;nbsp;</td><td>no longer commercially available</td><td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>USB</td><td>19628</td><td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>Corning</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Standard coverslip</td><td>Fisher</td><td>12-544-E or 12-540-B</td><td></td></tr><tr><td>High resolution coverslips</td><td>Fisher</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Photo-Flo 200 solution</td><td>Kodak</td><td>P-7417</td><td>Prepare 0.2% (v/v) solution in water.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4&amp;deg;C for up to a month.</td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>IgG (H+L) Antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting media with DAPI</td><td>Vector&lt;br/&gt; Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Plastic slide box</td><td>Fisher</td><td>03-448-1</td><td>Store slides containing dried spreads in slots at -20&amp;deg;C. Also, use as a wet chamber.</td></tr><tr><td>Cardboard slide box</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td>Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Coplin jar</td><td>Fisher</td><td>08-816</td><td>Use as a wash basin for slides.&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

surface spreading and immunostaining of yeast chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

확산 핵의 모양은 매우 염색체 고정 및 드 압축 사이의 균형에 따라 달라집니다. 시약이 적절하게 균형 때에도 염색체 디 응집도의 변동 및 / 또는 다른 슬라이드 간 동일한 슬라이드의 상이한 영역에서 발생할 수있다. 화상 해석되기 전에 따라서, 슬라이드의 소정 영역에 확산의 품질을 평가한다. &#39;전면 도포&#39;와 &#39;underspreading &quot;의 효과는 감수 분열 재조합 단백질에...

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Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

표면 확산과 효모 염색체의 면역 염색

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

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Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

버딩 효모에서 단백질 농도의 함수로 형태학의 표현형의 발전 분석

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

연구

생물학

Visualizing Yeast Organelles with Fluorescent Protein Markers

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have constructed fluorescent protein-based markers for major organelles and endomembrane structures, including the nucleus, endoplasmic reticulum (ER), Golgi apparatus, endosomes, vacuoles, mitochondria, peroxisomes, lipid droplets, and autophagosomes. The protocol presented here describes the procedures for using these markers in yeast, including DNA preparation for yeast transformation, selection and evaluation of transformants, fluorescent microscopic observation, and the expected outcomes. The text is geared toward researchers who are entering the field of yeast organelle study from other backgrounds. Essential steps are covered, as well as technical notes about microscope hardware considerations and several common pitfalls. It provides a starting point for people to observe yeast subcellular entities by live-cell fluorescent microscopy. These tools and methods can be used to identify protein subcellular localization and track organelles of interest in time-lapse imaging.

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Here we describe the use of a set of fluorescent protein-based organelle markers in live-cell imaging of the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have ...

생화학

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

효모 콜로니 임베딩 방법

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray 분석을위한 Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

분열 효모의 양적 라이브 세포 형광 - 현미경 분석

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

시투 혼성화에서 형광을 사용하여 뮤린 위장에서 칸디다 알비칸스의 시각화

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

면역학 및 감염병학

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

분열 효모 성적 라이프 사이클의 현미경

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

형광 라이브 세포 현미경 검사법에 의한 미토틱 및 Meiotic 핵분열 효모 핵 역학의 검사

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

표면 확산과 효모 염색체의 면역 염색

요약

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