This work was supported by NIH grant GM50936 to DKB.

참고 : 프로토콜의 일부 단계 아래 깨끗한 흄 후드에서 작업이 필요합니다. 또한, 상기 방법은 spheroplasting을 모니터링 10X 작동 거리가 긴 대물 렌즈를 구비 한 효모 테트라 해부 현미경을 필요로한다. 현미경은 미리 후드에 설치해야합니다. 범위에서 미세 조작기의 팔과 판 홀더를 제거하고 멀리 작업 영역에서 안전한 장소에 이러한 항목을 배치합니다. Spheroplasts 1. 준비 <ol><li> 원하는 조건 하에서 효모 성장. OD600 = 1.4 5 × 107 세포 / ㎖에서 각각의 샘플에 대해 2 × 108 세포, 즉 배양 4㎖를 사용. 샘플의 즉각적인 처리가 어떤 경우에는 바람직 할 수 있지만, 대부분의 애플리케이션에 대해, 세포 분취 액 처리되기 전 최대 8 시간 동안 얼음 상에 저장 될 수있다. </li><li> 세포 펠렛 3 분 5 (2345 RPM / 857.5 XG)를 설정에서 임상 원심 분리기에 15 ml의 원심 분리기 튜브와 스핀에 세포 현탁액을 전송합니다. </lI&gt; <li> 펠렛에서 세포를 잃지 않도록 매체 복용 치료를 가만히 따르다. 부드럽게 1 ML의 ZK 버퍼에있는 세포를 재현 탁하고 40 μL 1 M 디티 오 트레이 톨 (DTT)를 추가합니다. 부드러운 혼합 2 분을 품어. 세포 펠렛은 이전처럼 (단계 1.2 참조). </li><li> 1 ML의 ZK 버퍼에 재현 탁 펠렛. 완전히 혼합 된 zymolyase 100T의 새로 제조 액 5 μl를 추가합니다. 세포벽을 제거한 spheroplasts을 제조 30 ℃에서 20-30 분 동안 인큐베이션. </li><li> spheroplasting가 완료되었는지를 결정하기 위해 현미경 슬라이드에 세포 현탁액 10 μL 액적 분석. 커버 슬립없이 해부 현미경으로 본 세포. 세포가 부풀어 둥근보다는 약간 타원형 표시해야하며, 물 20 ㎕를 첨가 한 다음 용균한다. 세포 용균하지 않으면 물에 의한 분해가 쉽게 관찰 될 때까지 매 10 분, 30 ℃로 샘플을 반환하고 다시 분석. 세포 펠렛은 이전처럼 (단계 1.2 참조). </li><li> 부드럽게 재현 탁 세포 펠렛 내가 씻어N 2.5 ml의 차가운 MES / 소르비톨 버퍼입니다. 세포 펠렛은 이전처럼 (단계 1.2 참조). 부드럽게 300-400 μL 감기 MES / 소르비톨 버퍼에 세포 펠렛을 재현 탁. 세포를 수 시간 동안이 단계에서 얼음에 보관 될 수있다. </li></ol> 확산 2. 염색체 참고 : 염색체 - 확산 중 슬라이드 나 될 때 유리 표면 된 커버는-한다 미리 준비하십시오. 각 슬라이드 또는 커버 슬립이 물에 잠긴해야하고 EtOH로는, 다음 건조시키고, 렌즈 페이퍼로 연마. 염색체가 된 커버에 확산 될 경우, 커버 슬립은 스카치 테이프 나 고무 시멘트와 슬라이드에 부착해야한다. 특별히 언급하지 않는 한, 프로토콜의 나머지 부분은 하나의 슬라이드 나 커버 슬립 확산 설명한다 <ol><li> 깨끗한 슬라이드의 표면에 P20의 피펫, 피펫 세포 현탁액 20 μL를 사용. </li><li> P200에 피펫을 사용하여, 3 % PFA / 수크로오스 용액 40 μL를 추가하고 부드럽게 혼합 solutio슐 리렌 라인이 사라질 때까지 손으로 슬라이드를 &quot;소용돌이&quot;에 의해 N. 현미경 슬라이드를 놓고 세포에 초점이 있음을 확인합니다. PFA 솔루션은 사용 당일 흄 후드에서 갓 준비를해야합니다. 주 : 관심의 단백질이 이전의 방법에 의해 조사되지 않은 경우, 그 단백질의 보존이 정착 조건에 민감인지 확인 (2) 및 4 % PFA를 포함하는 용액을 사용하여 추가 슬라이드를 준비하는 것이 바람직하다. 4 % PFA / 수크로오스 용액은 미세 소관 연관 튜 불린을 시각화 바람직한 경우에 사용된다. 높은 정착 농도의 단점은 염색체가 될 것입니다 &quot;underspread,&quot;2 % PFA는 &quot;underspread&quot;염색체를 생성하는 경향이있다. </li><li> P200의 피펫을 사용하여, 완전히 가능한 한 솔루션을 혼합하기 전에 소용돌이, 타이머를 시작, 1 % Lipsol의 80 μl를 추가합니다. Lipsol를 사용할 수없는 경우, 80 μL 1 % NP40 80 μL의 DH 2 O가 될 수있다(그림 2를 대표 결과를 참조) 교체. </li><li> 슬라이드마다 15 초 소용돌이 조심스럽게 부드럽게 세포를보십시오. 세포의 약 80 %가 용해되면, 즉시 현미경에서 슬라이드를 제거, 타이머를 중지 PFA / 자당 용액 80 μl를 추가하고, 소용돌이 혼합 (사라). 용해는 타이머를 시작한 후 30 사이에 90 초에서 발생한다. 주 : 여러 슬라이드 거의 동시에 용해를 보여 주면, 하나 결국 슬라이드의 나머지 현미경 모니터링을 생략하고 단순히 신중 lipsol 및 고착성의 최종 분취 량의 첨가의 첨가 기간을 사이에 시간이있다. 동일한 샘플에서 여러 슬라이드를 준비 할 때 그러나,이 지름길은 신뢰할 수있다. 다른 슬라이드가 서로 다른 시간에 촬영 한 샘플이나 다른 문화에서 준비 때 현미경으로 각 샘플의 용해를 모니터링하는 것이 가장 좋습니다. </li><li> 깨끗하고 평평한 표면에 슬라이드를 삽입하고 전체 unfrosted SURFAC에 걸쳐 액체를 확산「웅덩이」의 메 니스 커스 아래에 있지만, 즉 슬라이드 자체의 표면 위에 유지 깨끗한 목장 일회용 피펫의 측면을 사용하여 슬라이드의 전자. 피펫과 슬라이드의 표면을 &quot;긁어&quot;하지 않습니다. 샘플의 오염을 방지하기 위해 다른 슬라이드에 피펫을 재사용하지 마십시오. </li><li> 흄 후드에서 하룻밤 건조 슬라이드를 남겨주세요. 불용 성분은 핵 슬라이드 표면에 정착하고 결합한다. 많은 실험에서, 건조 단계를위한 공간의 사용을 계획하는 것이 중요하다. </li><li> 건조 후에, 최적의 결과는 같은 날 면역 단계로 진행하여 획득된다. 그러나, 건조 수크로오스 용액을 동결 샘플을 허용 &quot;꿀&quot;의 확산 염색체를 내장 : 슬라이드는 슬라이드 플라스틱 상자로 옮기고 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol> 3. 면역 염색 <ol><li> 30 초 동안 0.2 % 사진 - 플로의 딥​​ 슬라이드. 꿀을 제거합니다. 에 린 슬라이드모서리, 가장자리는 종이 타월에 쉬고, 잔류 포토 플로를 제거합니다. </li><li> 5 분 1X TBS에서 딥 슬라이드 씻어. 가장자리에 슬라이드를 기대어으로 물기를 제거하지만, 그들을 건조하게하지 않습니다. </li><li> 면을 위로, 피펫 300 μL TBS / BSA 슬라이드의 unfrosted 부분에서 슬라이드에 프로스트 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 15 분 동안 실온에서 습기 챔버에 품어. (포화 종이 타월로 천공 된 금속판 또는 플라스틱 슬라이드 상자에서 물 포화 종이 타올 늘어서 대형 플라스틱 용기). </li><li> 종이 타월에 슬라이드의 짧은 가장자리 휴식 (예 : 테스트 튜브 랙 등) 적절한 지원에 대한 슬라이드를 기대어으로 슬라이드를 배출합니다. 표면이 건조하지 않도록하십시오. </li><li> 즉시 차 항체의 적절한 희석을 포함하는 TBS / BSA 버퍼의 80 μl를 적용합니다. 항체가 제한되어있는 경우, 40 μL와 22 X 22mm의 coverslip에 사용합니다. 조 토끼 혈청의 경우, 이는 전형적으로 1/50 1/500 희석 사이이다. 노트:새로운 항체 제제에 적정을 수행합니다. 배경 위의 높은 신호를 산출 가장 묽은 준비가 선택됩니다. 사전 면역 혈청으로 염색해야한다 배경 염색의 레벨에 맞는 제어하기 위해, 핵은 해당 삭제 돌연변이 균주 및 / 또는 중복 슬라이드에서 준비를해야합니다. </li><li> 거품을 피하는 슬라이드에 광택 22 X 50mm의 coverslip에 배치합니다. 하나의 짧은 가장자리 근처에 위치에 긴 가장자리를 따라 엄지 손가락과 검지 손가락 사이의 커버 슬립을 개최하여이 작업을 수행합니다. 30 °의 각도로 커버 슬립을 잡고 그냥 &quot;웅덩이&quot;슬라이드의 프로스트 지역에 가장 가까운 가장자리 안쪽 슬라이드에 닿을 때까지 손가락의 짧은 가장자리 먼이 저하되고, 슬라이드. 그런 다음 천천히 슬라이드 터치 벤치를 잡고 손가락까지 부드러운 동작으로 커버 슬립을 절감하고 놓습니다. 이 땅을 한 번 커버 슬립의 위치를​​ 조정하지 마십시오. 참고 : 염색체 스프레드가 준비 되었다면부착 된 커버 (보다는 직접에 슬라이드의 표면),이 샘플 커버 슬립은 염색 및 세척 단계에 걸쳐 슬라이드에 부착 된 상태로 유지됩니다. 추가 커버 슬립은 염색 후 폐기시 균일 항체 용액을 분배하는 샘플 커버 슬립 위에 배치 될 것이다. </li><li> 밀봉 된 습기 챔버에 넣어 슬라이드 및 4 ℃에서 밤새 품어. </li><li> 유리 슬라이드 염색 랙에 프로스트 에지 전송에게 슬라이드를 잡고 TBS를 포함하는 염색 항아리에 잠수함. </li><li> 부드럽게 커버 슬립을 제거하기 위해 위 아래로 슬라이드를 찍어. 이 작업을 수행하기 위해 너무 많은 힘을 사용하지 않도록하십시오. TBS에서 침수에 의해 10 분 2 배 슬라이드를 씻으십시오. 랙에서 슬라이드를 제거하고 종이 타월에 가장자리를 터치하여 초과 액체를 배출. 표면 건조하게하지 마십시오. </li><li> 부드러운 조명 아래에서 작업을 즉시 80 μL TBS / BSA는 형광 색소 결합 된 이차 항체 (또는 22 X 22mm의 coverslip에 40 μL)의 1 / 1,000 배 희석액을 포함하는 추가합니다. 광고그리고 이전과 개발 커버 슬립은 어둠 속에서 습한 챔버에서 2 시간 동안 4 ° C에서 품어. </li><li> 이전으로 된 커버를 제거 슬라이드를 배출하고, 어둠 속에서 1 ~ 2 시간 동안 자연 건조에 표면을 할 수 있습니다. 이전과 종이 타월에 엎드려서 슬라이드. 참고 : 확산하는 것은 장착 커버 슬립에 수행 된 경우, 건조하기 전에 슬라이드에서 커버 슬립을 분리합니다. 이전 단계에서 설명한 바와 같이 슬라이드의 커버 슬립을 건조한다. </li><li> 부드러운 조명 아래에서 작업, DAPI (세 10 μL 방울)를 포함하는 매체를 장착 약 30 μl를 추가 한 다음 조심스럽게 커버 슬립을 낮 춥니 다. 스프레드가 된 커버에있는 경우, 깨끗한 슬라이드에 장착 매체의 방울을 배치하고 슬라이드에, 아래로 커버 슬립, 염색체 측을 내립니다. </li><li> 여전히 부드러운 조명 아래, 정착 분명 매니큐어와 커버 슬립의 가장자리를 밀봉 coverslip에 대한 2 분을 기다립니다. 평면 슬라이드 상자에 슬라이드를 놓습니다. 참고 : STED 현미경, 연장 금으로 마운트합니다. 연장 금의 30 μl를 사용하여및 DAPI없이 하룻밤 치료 할 수 있습니다. 매니큐어로 밀봉하는 것은 불필요하다. </li><li> 40 100X 목적은 DAPI가 초점을위한 적절한 설정 필터를 사용하여와 위드 표면 형광 현미경으로보기 슬라이드. 선택적으로 몇 주 동안 4 ° C에서 어둠 속에서 슬라이드를 저장합니다. 냉동하지 마십시오. </li></ol>

<ol>
	<li>Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+synapsis+in+a+haploid+yeast.">Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast.</a> Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).</li><li>Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+morphological+approaches+for+the+analysis+of+meiotic+chromosomes+in+yeast.">Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast.</a> Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).</li><li>Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meiotic+recombination+checkpoint+controlled+by+mitotic+checkpoint+genes.">A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes.</a> Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).</li><li>Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecA+homologs+Dmc1+and+Rad51+interact+to+form+multiple+nuclear+complexes+prior+to+meiotic+chromosome+synapsis.">RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 79, 1081-1092 (1994).</li><li>Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+identifies+Monopolin:+a+kinetochore+protein+required+for+segregation+of+homologs+during+meiosis+I.">Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I.</a> Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).</li><li>Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+RecA-like+recombinases:+Distinct+roles+for+mediator+proteins+in+mitosis+and+meiosis.">Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis.</a> PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).</li><li>Biggins, S., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+budding+yeast+protein+kinase+Ipl1/Aurora+allows+the+absence+of+tension+to+activate+the+spindle+checkpoint.">The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint.</a> Genes &amp; Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).</li><li>Dresser, M. E., Giroux, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+behavior+in+spread+preparations+of+yeast.">Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast.</a> The Journal of Cell Biology. , (1988).</li><li>Lao, J. P., Cloud, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+crossover+control+by+concerted+action+of+Rad51-Dmc1+in+homolog+template+bias+and+robust+homeostatic+regulation.">Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation.</a> PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).</li><li>Vonesch, C., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+thresholded+landweber+algorithm+for+wavelet-regularized+multidimensional+deconvolution.+IEEE+transactions+on+image+processing+:+a+publication+of+the.">A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the.</a> IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

The appearance of spread nuclei critically depends upon the balance between fixation and lysis/detergent treatment. As discussed above, the preservation of varying cellular structures requires the use of different PFA concentrations. For most proteins, 3% PFA is optimal. However, preservation of spindles requires use of 4% PFA. Even with a single set of reagents, the timing of lysis relative to fixation can also affect the quality of spread nuclei. For the most consistent results, the time of lysis should be normalize...

출아 효모 사카로 마이 세스 세레 비지 염색체 기능을 조절하는 단백질에 대한 연구를 포함한 생물학적 과정의 분자 메커니즘의 연구에 많은 이점을 제공한다. 유전 적 분자 및 생화학 적 연구를위한 효모 신진의 공지의 장점이 있지만, 세포의 핵 단백질의 분포의 세포 학적 연구는 작은 크기에 의해 복잡하게된다. 전형적인 효모 핵은 가시광의 단지 약 5 배의 해상도 한계 미만 1 미크론의 직경을 갖는다. 따라서, 종래의 면역 염색에서 또는 녹색 형광 단백질 (GFP)과 같은 형광 단백질 태그를 사용함으로써 얻어 질 수 핵 단백질의 분포에 대한 정보의 양이 제한된다. 단백질 subnuclear 분포를 특성화하는 유용한 방법은 확산 염색체 표면이다. 이 접근법은, 세포벽을 제거하고 세포 핵막 및 중단을 포함llowing 핵의 불용 내용 현미경 슬라이드의 표면에 정착한다. 이 불용성 성분은 핵 매트릭스와 염색체를 포함한다. 염색질 결합 단백질을 감지하는 능력을 향상 가용성 핵 콘텐츠의 삭제를 가능하게하는 것 외에도, 이러한 확산 핵 주위이 3 μm 내지 5의 직경을 가지고 (이배체 감수 핵 대) 염색체의 실질적인 신장에있어서의 결과를 확산 염색체 2 배체 유사 분열 핵에 대한 μm의 3. 이 압축 해제는 그대로 핵에 해결할 상대적으로 어렵거나 불가능 핵 하부의 검출 할 수있다. 확산 염색체 명백한 단점은 확산 과정은 관심의 구조를 부분적으로 또는 완전히 중단 할 가능성이다. 특히 관심의 특정 염색체 결합 단백질 확산 과정의 결과로서 손실 될 수 있다는 것이다. 이 잠재적 인 합병증 수오데이터를 해석 할 때, LD는 명심. 확산 과정에 민감한 단백질의 하나의 예는 베타 - 튜 불린이다. 일부 조건 하에서, 주로 튜 불린 구성되는 스핀들, 3, 확산 중에 보존된다. 스핀들의 시각화는 종종 관심의 핵를 준비하는 데 유용합니다. 그러나, 튜 불린을 떠올리 고농도 정착액 치료를 필요로; 스핀들은 후술하는 표준 조건 하에서 손실된다. 이 예는 이전에 규명하지 않은 단백질의 분포를 분석 할 때, 그 단백질이 이러한 변화에 얼마나 민감한 결정 정착액의 농도를 변화시키는 것이 중요하다는 것을 나타낸다. 염색체 구조에 확산 조건의 영향에 대한 우려에도 불구하고, 확산 방법의 유용성 및 전원은 많은 콘텍스트에서 설명과 유사 분열의 특성화 및, 특히 4-7 감수 세포에 다양한 유틸리티가되었다. TWO 확산 방법이 널리 사용되어왔다. 드레서 및 지로 (8)에 의해 개발 된이 방법의 첫 번째, 세제의 사용을 회피하고, DNA 특이 적 염색을 위해 DAPI 염색 때 비교적 잘 보존 염색체 형태를 갖도록 표시 확산 제제를 수득 할 수있다. 그러나,이 방법은 완전 비교적 어렵고 하나의 슬라이드 영역이 다른 영역에 비교 될 때 확산 핵의 품질은 크게 달라진다. 이 문제는 데이터 수집 바이어스를 피하기 위해 하나의 슬라이드에서 다수의 선택되지 않은 핵 촬상 포함 정량적 방법을 복잡하게 할 수있다. Loidl과 클라인 (1)에 의해 개발 된 방법을 확산 번째 염색체는, 용해 및 세제에 의해 추진 염색질 압축 해제와 함께, 파라 포름 알데히드로 고정 균형을 포함한다. 제대로 수행되면,이 방법은 드레서와 지로 방법에 비해 적은 지역 간 지역 변화에 매우 재현 가능한 결과를 제공합니다. 이 프레젠테이션은 변형 된에 초점을 맞추고때문에 그것의 신뢰성과 단순성의 Loidl과 클라인의 방법의 D 버전. 염색체 확산은 복잡하거나 시간 소모적 아니다; 최대 100 슬라이드는 하루에 대한 면역 염색을 제조 할 수있다. 또한, 확산 제로는 종래 면역 년 동안 냉장고에 저장 될 수 있고, 이에 따라 랩 새로운 생물학적 질문이 발생하거나 새로운 염색 시약이 제공 될 때 사용할 수있는 냉동 염색체 스프레드 저장소를 개발할 수있다. 염색체 확산 방법이 가장 일반적으로 면역 염색과 위드 형광 현미경과 조합하여 사용되지만, 그와 같은 유도 방출 고갈 (STED) 현미경 등의 수퍼 - 해상도 광 현미경 방법을위한 슬라이드를 제조하는 것도 가능하다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zymolyase</td>
			<td>US Biological&#160;</td>
			<td>Z1004</td>
			<td>Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4&#176;C until ready for use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipsol&#160;</td>
			<td>L.I.P. Ltd&#160;</td>
			<td>no longer commercially available</td>
			<td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>USB</td>
			<td>19628</td>
			<td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2948-75x25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard coverslip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-E or 12-540-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High resolution coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-542-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200 solution</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>P-7417</td>
			<td>Prepare 0.2% (v/v) solution in water.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4&#176;C for up to a month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG (H+L) Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting media with DAPI</td>
			<td>Vector 
			Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic slide box</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-1</td>
			<td>Store slides containing dried spreads in slots at -20&#176;C. Also, use as a wet chamber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard slide box</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td>Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-816</td>
			<td>Use as a wash basin for slides.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface spreading and immunostaining of yeast chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

확산 핵의 모양은 매우 염색체 고정 및 드 압축 사이의 균형에 따라 달라집니다. 시약이 적절하게 균형 때에도 염색체 디 응집도의 변동 및 / 또는 다른 슬라이드 간 동일한 슬라이드의 상이한 영역에서 발생할 수있다. 화상 해석되기 전에 따라서, 슬라이드의 소정 영역에 확산의 품질을 평가한다. &#39;전면 도포&#39;와 &#39;underspreading &quot;의 효과는 감수 분열 재조합 단백질에...

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Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

표면 확산과 효모 염색체의 면역 염색

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

surface-spreading-and-immunostaining-of-yeast-chromosomes

Research

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Biology

9.8K 조회수.  University of Chicago. A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

비디오: Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

높은 처리량 효모 플라스미드 Overexpression 화면

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

연구

생물학

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

높은 활성 효모 변이의 색층 정화

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

해부 Zebrafish 배아 심장의 Immunostaining

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

낮은 친화력 세포 수용체 - 리간드 상호 작용의 확장 가능한 감지를위한 욕망 기반의 세포 상호 작용 검사 (AVEXIS)

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

자동을 사용하여 염색체의 높은 처리량 물리적 매핑<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

해부하고, 상상 디스크의 면역 염색에서<em&gt; 초파리</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

형광 DNA를위한 간단한 방법<em&gt; 현장에서</em&gt; 숙청 염색체에 하이브리드

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

분열 효모 성적 라이프 사이클의 현미경

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and development. Cytokinesis involves a series of events that are well coordinated in time and space. Cytokinesis involves the formation of an actomyosin ring at the division site, followed by ring constriction, membrane furrow formation and extra cellular matrix remodeling. The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe (S.&#160;pombe)&#160;is a well-studied model system that has revealed with substantial clarity the initial events in cytokinesis. However, we do not understand clearly how different cytokinetic events are coordinated spatiotemporally. To determine this, one needs to analyze the different cytokinetic events in great details in both time and in space. Here we describe a microscopy approach to examine different cytokinetic events in live cells. With this approach it is possible to time different cytokinetic events and determine the time of recruitment of different proteins during cytokinesis. In addition, we describe protocols to compare protein localization, and distribution at the site of cell division. This is a basic protocol to study cytokinesis in fission yeast and can also be used for other yeasts and fungal systems.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe&#160;is an excellent model system to study cytokinesis, the final stage in cell division. Here we describe a microscopy approach to analyze different cytokinetic events in live fission yeast cells.

분열 효모의 Cytokinetic 이벤트의 시공간 분석

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...