This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).

1. SPPS: CK TATG סינתזה (TMR) (fTAT) הערה: dfTAT מיוצר בשני שלבים: סינתזה של fTAT מונומר בסינתזה פפטיד השלב מוצקה ואחרי דיסולפיד אג&quot;ח dimerization כדי ליצור dfTAT. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתנפח 500 מ&quot;ג של שרף MBHA אמיד החלקה בdimethylformamide (DMF) בכלי SPPS 50 מיליליטר סטנדרטי עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע deprotection FMOC ידי דוגרים שרף FMOC המוגן בפתרון piperidine 20% (20% בpiperidine DMF, 10 מיליליטר (0.30 mmol). לבצע צעדי deprotection פעמיים (באמצעות 1 x 5 דקות ו 1 x 15 דקות) בצעד כביסה DMF (שלב הכביסה כולל שטיפת השרף מספר פעמים בהיקף כולל של כ 150 מיליליטר של DMF והסרת הממס על ידי סינון ואקום) בין תגובות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנתז CK RKKRRQRRRG (TMR) (fTAT) על שרף MBHA אמיד החלקה. השתמש הבא FMOC מוגן חומצות אמינו: FMOC יס-אה (MTT) (רק בN-סופית), FMOC-ליס (בוק) אה, FMOC-גלאי-OH, FMOC-Arg (PBF) אה, Fmoc- GLN (TRT) אה, וFMOC-Cys (TRT) אה. לבצע את התגובה באמצעות N 2 (20 PSI) כדי להתסיס את התגובה. לבצע את כל התגובות בRT. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע כל תגובת צימוד חומצת אמינו במשך 4 שעות. לכל צימוד, להשתמש FMOC מוגן חומצת אמינו (1.2 mmol), N, N, N &#39;, N&#39; -Tetramethyl- O- (1 H -benzotriazol-1-י.ל) hexafluorophosphate uronium (HBTU) (0.44 גר &#39;, 1.1 mmol ), וdiisopropylethylamine (DIEA) (0.51 מיליליטר, 3.0 mmol) מומס בDMF. בעקבות צימוד 4 שעות, לשטוף את השרף עם DMF ולבצע את צעד deprotection FMOC כמתואר בשלב 1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה עד השרשרת ליניארית פפטיד של fTAT (שרשרת הפפטיד ליניארית: CKRKKRRQRRRG לא TMR) הייתה מסונתזת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן לשטוף ביסודיות באמצעות שרף DMF הראשון והבא שעם dichloromethane (DCM). יש לשטוף את השרף מספר פעמים בהיקף כולל של כ 150 מיליליטר של DMF או DCM ולהסיר את הממס על ידי סינון ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Use MALDI-TOF כדי לאשר שיש פפטיד שהושג משקל המולקולרי הנכון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך תערובת מטריצה ​​על ידי הוספת 1 מ&quot;ג של מטריצה ​​לפתרון המורכב של 50 μl של 0.01% TFA בפתרון מים ו -50 μl של אצטוניטריל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאשר המוני שרשרת הפפטיד ליניארי, להשתמש חומצת α-Cyano-4-hydroxycinnamic. הפעל HPLC אנליטי של פפטיד הגולמי ולאסוף 50 μl מהחלק העליון של השיא הטהור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את המדגם לצלחת על צלחת MALDI: הוסף 8 μl של פפטיד 2 μl של פתרון המטריצה ​​ומניחים על צלחת MALDI לייבוש באוויר או על צלחת חום 37 מעלות צלזיוס. הערה: ארגינין ידוע להיות חומצת אמינו קשה זוג בSPPS. צימוד מוצלח הוקם על ידי ביצוע בדיקת קייזר 14 (מבחן לדוגמא, ninhydrin). בדיקה זו מאפשרת זיהוי של אמינים חופשיים שעלולות להישאר נחק על השרף. במקרה צבע כחול מזוהה (מעיד על הנוכחות של אמינים חופשיים) של צימוד,teps חוזרים. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לCK (-NH-TMR) TATG (fTAT), לדבוק קבוצת הגנת MTT בקבוצת -amino של יס על CK TATG (-NH-MTT) עם פתרון המורכב של 1% חומצת trifluoroacetic (TFA) וtriisopropylsilane 2% (TIS) בDCM. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כהסרה של קבוצת הגנת MTT תביא את המראה של צבע צהוב, דגירה השרף עם 20 מיליליטר של הפתרון מעל 5 דקות, לחזור על זה עד שלא צבע צהוב הוא ציין. לשטוף את השרף עם DCM וDMF שביניהם. בנוסף מאז TIS היא נבלות שהיו ללקט MTT, פעם אחת לא צבע צהוב מופיע בפתרון בנוכחות MTT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף פתרון נוסף עם 1% TFA בDCM (לא TIS) לשרף להבטיח לא יותר MTT הוא שהוסר ונשאר הפתרון ברור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את שלושת מרכיבים: Carboxytetramethylrhodamine (TMR), HBTU, וDIEA (4, 3.9 ו -10 שקילות ביחס לסכום של שרף (במ&quot;ג)) בDMF ולהוסיף את התערובתלשרף ולבצע O התגובה / N באמצעות N היבש 2 לספק תסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות FMOC-deprotection ונטיית חומצת אמינו, לשטוף את השרף עם DCM ולאפשר לו להתייבש. למחשוף של הפפטיד מהשרף שלם, להוסיף תמיסה המכילה 92.5% TFA, 2.5% H 2 O, 2.5%, טופ אימג &#39;, וethanedithiol 2.5% (EDT) (נפח כולל = 4 מיליליטר) לpeptidyl-השרף עבור 3 שעות על RT כדי להשיג deprotection הגלובלי ומחשוף מהשרף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזרז את מוצרי פפטיד הגולמי באמצעות אתר אתיל נטול מים קר (Et 2 O) על ידי ניקוז הפתרון מצעד 1.6 ל -40 מיליליטר של Et 2 O, הספין הזה למטה על 4 מעלות צלזיוס ו4,000 XG למשך 20 - 25 דקות. חזור על שלב זה כדי לאפשר שטיפת המשקע עם נטול מים קרים Et 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend משקעים במים (5 מיליליטר או עד המשקע הוא נמס לגמרי) וLyophilize. אז resuspend המוצרים שהושגו ב0.1% TFA / אצטוניטריל המימי. </li></ol></li> &lt;li&gt; ביצוע ניתוח HPLC עם טור C18 אנליטיות (5 מיקרומטר, 4 x 150 מ&quot;מ) לנתח כל פפטיד. השתמש בקצב זרימה של 1 מיליליטר / דקה, וזיהוי ב214 ננומטר ו -550 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע HPLC למחצה preparative על עמודת 10 x 250 מ&quot;מ C18 לטיהור פפטיד. השתמש בקצב זרימה של 4 מיליליטר / דקה, וזיהוי ב214 ננומטר ו -550 ננומטר. לכל הריצות, להשתמש הדרגתיים ליניארי של 0.1% TFA (ממס) המימי ואצטוניטריל 90%, 9.9% מים, ושל 0.1% TFA (ב ממס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר את הזהות הנכונה של פפטידים על ידי MALDI-TOF פי הפרוטוקול של היצרן: fTAT, מסה צפויה: 2,041.17, מסה נצפתה: 2,040.66. דיק,-K9, צפוי המוני: 1,412.97, נצפה המוני: 1,415.59. השתמש במטריצת חומצת α- cyano-4-hydroxycinnamic לMALDI-TOF. </li></ol> 2. תגובת חמצון: dfTAT דור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאוורר נאגר מלוח פוספט pH (PBS) 7.4 עבור שעה 1 (לפחות 5 מיליליטר לתגובה בהמשך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים fTAT (0.3 מ&quot;ג, 1.5 x 10 -4 mmol) בAERated PBS pH 7.4 (5 מיליליטר). ודא שה- pH הוא בין 7.0-7.5 לאחר התוספת של הפפטיד. אם לא להוסיף נתרן הידרוקסידי (1 M, במרווחים קטנים 1 - 5 μl) להביא את ה- pH חזרה עד 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: החמצן המומס בPBS פועל לחמצן קבוצות תיאול על fTAT וליצור קשר דיסולפיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Nutate O התגובה / N כדי לאפשר לו להגיב עד להשלמה (תשואה של 100% על סמך ניתוח HPLC). לטהר את המוצר באמצעות HPLC ההפוך-שלב ולנתח על ידי ספקטרומטריית מסה (MALDI-TOF) כמו בשלב 1.9. מסה צפויה: 4,080.34, נצפתה המונית: 4,084.21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (X10 0.71 -4 mmol) Lyophilize הטהור dfTAT וגלול במי 200 μl (ריכוז מיקרומטר = 356.3 dfTAT הטהור). </li></ol> 3. מדידת ריכוז dfTAT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend aliquot של dfTAT (μl בדרך כלל 1 בהתאם לכמות של פפטיד המטוהרים) המטוהר ב149 μl של 50 מ&quot;מ פתרון TCEP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: בשלב זה dfTAT מצטמצם מועמית nomer fTAT לחסל את מרווה הספיגה שמתרחשת עקב הקרבה של fluorophore TMR בdfTAT (ε מקדם הכחדה של TMR בdfTAT מופחת בהשוואה לε של TMR בfTAT המופחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר את המדגם כדי להגיב לכ -20 דקות (HPLC אנליטי ניתן להשתמש כדי לאשר הקמת fTAT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את כל הפתרון לקובט קוורץ ולמדוד את הספיגה ב 556 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בחוק של באר (= εcl: ε = 91500 M -1 סנטימטר -1) כדי לחשב את הריכוז של fTAT, לקבוע את הריכוז של dfTAT, ולחלק [fTAT] על ידי שתי. </li></ol> 4. ניסויי משלוח סלולריים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי התאים (הלה, HDF, וכו &#39;.) בצלחת בconfluency של 80 - 90% (לדוגמא, מנה 8 היטב או 24 גם). לגדל תאים במדיום מתאים (למשל, DMEM בתוספת 10% FBS ופן / סטרפטוקוקוס) עד 80 - confluency 90% ב37 מעלות צלזיוסאווירת humidified המכילה 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים שלוש פעמים (3X) עם PBS (על ידי הוספת 200 μl של PBS ולאחר מכן להסיר אותו שלוש פעמים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך ריכוז עובד 5 מיקרומטר של dfTAT על ידי דילול מניות של dfTAT (במים) בNRL-15 תקשורת (ל8 גם לחלק את הנפח הכולל צריך להיות 200 μl). ריכוז של 5 מיקרומטר dfTAT מוביל לאספקה ​​יעילה (רמה גבוהה של משלוח cytosolic בלמעלה מ -90% מתאים הנמצאים בצלחת) ברוב סוגי התאים נבדקו עד כה (איור 3). עם זאת, ריכוזים נמוכים יותר או גבוהים יותר עשויים להיות מתאימים יותר לסוגי תאים עם נטייה גבוהה או נמוכה לחדירה. הערה על אמצעי תקשורת: NRL-15 משמשת למשלוח של dfTAT שכן הוא אינו מכיל ציסטאין אשר יכול להפחית את קשר דיסולפיד בdfTAT. עם זאת, הנתונים שלנו מצביעים על כך ששניהם DMEM הרגיל L-15 (עם ציסטאין) ויכול לשמש כאמצעי תקשורת המשלוח. L-15 מכיל חומצת אמינו ציסטאין הפחתה אבל presumab ציסטאיןly מתחמצן בתקשורת כדי ליצור ציסטין (DMEM הוא ניסח עם ציסטין). dfTAT לכן נותר בשלמותה בתקשורת אלה והמשלוח עובד באותה היעילות כמו שהושג עם nrL15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עם dfTAT (5 מיקרומטר) עם או בלי מטען (למשל., EGFP (10 מיקרומטר)) ולשמור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 (זמן דגירה יכול להיות מופחת אבל dfTAT בדרך כלל דורש כ -30 עד 45 דקות כדי לגרום לדליפת endosomal ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם הפרין (1 מ&quot;ג / מיליליטר) בL-15 (3 שוטף מומלץ) כדי להסיר dfTAT חייב קרום הפלזמה של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עם כתם גרעיני תאים אטומים, למשל., Sytox כחול, ירוק Sytox (2 מיקרומטר בNRL-15), כדי לקבוע אם קרום הפלזמה של תאים נפגעת (תאים מתים יהיו מוכתמים בזמן תאי חיים לא) על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (טבילת שמן 100X או אובייקטיבי 20X). תמונת dfTAT באמצעות מסנן RFP (אקס =560 ± 20 ננומטר / Em = 630 ± 35 ננומטר). הערה: משלוח מוצלח מוביל לקרינה מפוזרת של dfTAT ברחבי התא (הערכת המסירה של חלבון או פפטיד של עניין יהיה תלויה ביישום). הכתמה של nucleoli ידי fTAT (המוצר המופחת של dfTAT עם כניסת cytosolic) יכולה לשמש כאינדיקציה לכך שהקרינה שזוהתה היא תאית. fTAT יהיה לבזות בתוך כמה שעות. בשלב זה, הקרינה של שברי השפלה תופיע כpunctate. זה לא צריך להיות מבולבל להפצת punctate שהוא ראה גם אם dfTAT נשאר לכודה ללא הצלחה בתוך endosomes (זה יכול לקרות אם dfTAT נמצא בנמוך מדי של ריכוז). </li></ol> 5. ריכוז ניהול ושל משרד הפנים נמסר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את הריכוז &quot;משלוח אופטימלי&quot; הנדרש להשגת שחרור cytosolic יעיל של dfTAT בסוג התא בשימוש. בצע מיקרוסקופ פלואורסצנטי על תאים הודגרו עם increasinריכוזי גרם של dfTAT. ריכוז dfTAT האופטימלי מוגדר כריכוז המינימלי שמוביל כדי לנקות cytosolic &quot;לפזר&quot; הקרינה TMR בכ -100% מתאים בתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתנות הריכוז של משרד הפנים בשימוש בפרוטוקול שיתוף דגירה, תוך שמירה על הריכוז של קבוע dfTAT (למשל, באמצעות ריכוז המשלוח האופטימלי של dfTAT). שינוי זמן הדגירה לשעה פחות מ 1 יכול להיות גם אפשרות לשנות את הכמות של משרד הפנים נמסרו. </li></ol>

<ol>
	<li>Didenko, V. V., Ngo, H., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine+as+a+transmembrane+carrier+of+fluorescently+labeled+proteins+and+antibodies.">Polyethyleneimine as a transmembrane carrier of fluorescently labeled proteins and antibodies.</a> Anal Biochem. 344, 168-173 (2005).</li><li>Takeuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+Rapid+Cytosolic+Delivery+Using+Cell-Penetrating+Peptides+Mediated+by+Pyrenebutyrate.">Direct and Rapid Cytosolic Delivery Using Cell-Penetrating Peptides Mediated by Pyrenebutyrate.</a> ACS Chem Biol. 1, 299-303 (2006).</li><li>Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peptide+carrier+for+the+delivery+of+biologically+active+proteins+into+mammalian+cells.">A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells.</a> Nat Biotech. 19, 1173-1176 (2001).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+somatic+cells+via+TAT-mediated+protein+transduction+of+recombinant+factors.">Reprogramming of somatic cells via TAT-mediated protein transduction of recombinant factors.</a> Biomaterials. 33, 5047-5055 (2012).</li><li>Torchilin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+delivery+of+protein+and+peptide+therapeutics.">Intracellular delivery of protein and peptide therapeutics.</a> Drug Discov Today: Technol. 5, e95-e103 (2005).</li><li>Chakravarty, P., Qian, W., El-Sayed, M. A., Prausnitz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+molecules+into+cells+using+carbon+nanoparticles+activated+by+femtosecond+laser+pulses.">Delivery of molecules into cells using carbon nanoparticles activated by femtosecond laser pulses.</a> Nature nanotechnol. 5, 607-611 (2010).</li><li>Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+delivery+using+engineered+virus-like+particles.">Protein delivery using engineered virus-like particles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 16998-17003 (2011).</li><li>Pan, C., Lu, B., Chen, H., Bishop, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+human+fibroblasts+using+HIV-1+TAT+recombinant+proteins+OCT4,+SOX2,+KLF4+and+c-MYC.">Reprogramming human fibroblasts using HIV-1 TAT recombinant proteins OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC.</a> Mol Biol Rep. 37, 2117-2124 (2010).</li><li>Fittipaldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Membrane+Lipid+Rafts+Mediate+Caveolar+Endocytosis+of+HIV-1+Tat+Fusion+Proteins.">Cell Membrane Lipid Rafts Mediate Caveolar Endocytosis of HIV-1 Tat Fusion Proteins.</a> J Biol Chem. 278, 34141-34149 (2003).</li><li>Lee, Y. J., Erazo-Oliveras, A., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+macromolecules+into+live+cells+by+simple+co-incubation+with+a+peptide.">Delivery of macromolecules into live cells by simple co-incubation with a peptide.</a> Chembiochem. 11, 325-330 (2010).</li><li>Angeles-Boza, A. M., Erazo-Oliveras, A., Lee, Y. J., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+endosomolytic+reagents+by+branching+of+cell-penetrating+peptides:+tools+for+the+delivery+of+bioactive+compounds+to+live+cells+in+cis+or+trans.">Generation of endosomolytic reagents by branching of cell-penetrating peptides: tools for the delivery of bioactive compounds to live cells in cis or trans.</a> Bioconjugate chem. 21, 2164-2167 (2010).</li><li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O.">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3185-3190 (2001).</li><li>Erazo-Oliveras, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+delivery+into+live+cells+by+incubation+with+an+endosomolytic+agent.">Protein delivery into live cells by incubation with an endosomolytic agent.</a> Nat methods. 11, 861-867 (2014).</li><li>Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+test+for+detection+of+free+terminal+amino+groups+in+the+solid-phase+synthesis+of+peptides.">Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides.</a> Anal Biochem. 34, 595-598 (1970).</li><li>Muthukrishnan, N., Johnson, G. A., Lim, J., Simanek, E. E., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAT-mediated+photochemical+internalization+results+in+cell+killing+by+causing+the+release+of+calcium+into+the+cytosol+of+cells.">TAT-mediated photochemical internalization results in cell killing by causing the release of calcium into the cytosol of cells.</a> Biochim biophys acta. 1820, 1734-1743 (2012).</li><li>Lautwein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+B+lymphoblastoid+cells+contain+distinct+patterns+of+cathepsin+activity+in+endocytic+compartments+and+regulate+MHC+class+II+transport+in+a+cathepsin+S-independent+manner.">Human B lymphoblastoid cells contain distinct patterns of cathepsin activity in endocytic compartments and regulate MHC class II transport in a cathepsin S-independent manner.</a> J Leukoc Biol. 75, 844-855 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

התאים המשמשים למשלוח dfTAT לא צריך להיות יותר מדי מחוברות (&gt; confluency 90%) מאז זה עשויים להשפיע על יעילות המשלוח. התאים צריכים להיות גם בריאים: תאים מתים בתרבות יכולים לשחרר ברים אפופטוטיים עם שdfTAT יכול לקיים אינטראקציה (לדוגמא, ה- DNA מגרעינים מושפלים). זה בתורו יכול להפר...

<html> המשלוח של חלבונים, פפטידים או מולקולות קטנות תא חדיר לתאים חיים הוא לעתים קרובות רצוי ביישומים רבים ביולוגיים או ביוטכנולוגי (הדמיה סלולרית, מבחני פונקציונליים, תכנות מחדש של תאים, וכו &#39;.) 1-4. גישות משלוח רבות כבר דווחו, כולל microinjection, electroporation, או שימוש בסוכנים מובילים (לדוגמא., פפטידים חודרים תאים כגון TAT, שומנים) 5-7. כל טכניקה יש בדרך כלל יתרונות וחסרונות ספציפיים שעשויה להפוך את הגישות אלה מתאימים ליישומים מסוימים אך לא לאחרים. בעיות נפוצות כרוכות יעילות ירודה משלוח ו / או חוסר שליטה של כמה חומר מועבר 8,9, רעילות או השפעה פיזיולוגית מזיקה 10,11, חוסר שליטה זמנית, משלוח בכמה תאים, אך לא בכל אוכלוסייה (למשל., תוכניות microinjection) 12, ונטייה כימית מורכבת או ניסוח 11. <html> = &quot;Jove_content&quot; של&gt; לאחרונה, פיתחנו אסטרטגית משלוח רומן שעוקפת את המגבלות הללו. אסטרטגיה זו מסתמכת על פפטיד בשם dfTAT (דימר TAT ניאון) 13. dfTAT נגזר מפפטיד חודר התאים היטב יודעים (CPP) TAT. dfTAT מכיל שני עותקי דיסולפיד ערובה של תאת שכותרתו עם tetramethylrhodamine fluorophore. למרות דמיונם, תאת וdfTAT שונה באופן משמעותי בפעילות. תאת מופנמת בדרך כלל לתאים על ידי אנדוציטוזה. זה CPP נשאר עם זאת בעיקר לכוד בתוך endosomes (זה בדרך כלל יוביל להפצת punctate של פפטיד בתוך תאים כאשר נבדקו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי). כמו TAT, dfTAT הוא endocytosed ביעילות על ידי תאים. עם זאת, dfTAT לא להישאר לכוד בתוך endosomes. במקום זאת, הוא מתווך דליפת endosomal באופן שהוא יעיל מאוד. פעילות endosomolytic של dfTAT אז ניתן לנצל כדי לספק מקרומולקולות על ידי assay דגירה פשוט. ntent &quot;&gt; ההבנה הנוכחית של תהליך המשלוח היא כדלקמן. dfTAT גורם macropinocytosis. כתוצאה מכך, התאים הודגרו עם dfTAT לקחת את החלבונים מסיסים, פפטידים, או מולקולות קטנות (מולקולות של עניין, משרד הפנים) נוכחים בתקשורת על ידי נוזל-שלב אנדוציטוזה (ראה איור 1). אינטראקציות בין dfTAT ומשרד הפנים אינן נחוצות עוד שני ישויות התנועה יחד במסלול endocytic. כdfTAT מגיע לסף מסוים בתוך לומן של האברונים endocytic, הוא מבטא פעילות דליפת endosomal (פרטים המולקולריים להישאר להיות מאופיין במלואו). התוכן של לומן של האברונים דולפים, ולכן משרד הפנים, הוא שוחרר לאחר מכן לתאים. גישה זו היא אפוא מאוד נוחה כמו שאף תוכניות נטיה או ניסוח עם משרד הפנים נדרשות. יתר על כן, כי dfTAT הוא לא שינוי ישיר של משרד הפנים, הוא צריך גם לא להפריע לתפקוד MOIs פעם משלוח תאיים מושגת. בנוסף, הריכוזdfTAT משמש משלוח הוא עצמאי מזה של משרד הפנים בתקשורת. לדוגמא, ריכוז dfTAT יכול להישמר מתמיד בין ניסויים שונים כדי להבטיח יעילות לשחזור בדליפת endosomal. לעומת זאת, ריכוז של משרד הפנים בתקשורת ניתן לשנות בהדרגה כדי להשיג רמות רצויות של משרד הפנים נמסרו בcytosol. יעילות דליפת endosomal הגבוהה שהושגה עם dfTAT להפליא מזיקה לרב של התאים שנבדקו עד כה. זו הפתעה כי האברונים endocytic הם מרכיב חשוב של התאים וניתן היה לצפות כי הדליפה הדרמטית בתיווך dfTAT תהיה מלווה תגובות הסלולר מזיקות. עם זאת, תאים שטופלו להתרבות באותו קצב כמו תאים שלא טופלו ולא להציג כל שינוי משמעותי בtranscriptome. יתר על כן, משלוח ניתן לחזור תוך דקות עם יעילות משלוח לשחזור, מצביע על כך שתאים יכולים גם לסבול או להתאושש מתהליך הלידה מבלי לאבדהיכולת שלהם לאנדוציטוזה או דליפת endosomal. תגובות הסלולר עדינות עלולות להתרחש במהלך לידת dfTAT והפרטים המולקולריים של מה התגובות הללו עשויות להיות להישאר כדי להיחקר. ובכל זאת, על ידי שילוב של יעילות גבוהה, נוחות של פרוטוקולים, וחוסר הרעילות, גישת משלוח זה צריכה להוכיח מייד שימושית ביישומים מבוססי תאים רבים. הפרוטוקולים שהוצגו במסמך זה נועדו הפיכת טכנולוגיה זו נגישה לקהילת המחקר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Heparin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CAS 9041-08-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nrL15 L-15 (&#8211;) cysteine</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td></td>
			<td>Special order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-protected Amino acids</td>
			<td>Novabiochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dfTAT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>model IXB1</td>
			<td>equipped with a heating stage maintained at 37 &#176;C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C humidified, 5% CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of proteins, peptides or cell-impermeable small molecules into live cells by incubation with the endosomolytic reagent dftat

אסטרטגיות משלוח macromolecular בדרך כלל לנצל את מסלול endocytic כתוואי כניסה סלולרית. עם זאת, מלכוד endosomal מגביל מאוד את היעילות שבה מולקולות גדולות לחדור את מרחב cytosolic של תאים. לאחרונה, יש לנו לעקוף בעיה זו על ידי זיהוי מגיב dfTAT, קשר דיסולפיד דימר של תאת פפטיד שכותרתו עם tetramethylrhodamine fluorophore. יש לנו נוצר דימר כותרתו fluorescently של תאת הטיפוסית פפטיד חודר תאים (CPP), dfTAT, שחודר לתאים חיים, ומגיע לחלל cytosolic של תאים עם יעילות גבוהה במיוחד. משלוח cytosolic של dfTAT מושגת בשורות תאים מרובות, כוללים תאים ראשוניים. יתר על כן, משלוח אינו ניכר להשפיע על כדאיויות תא, התפשטות או ביטוי גנים. dfTAT יכול לספק מולקולות, פפטידים, נוגדנים, אנזימים פעילים ביולוגי קטנים וגורם שעתוק. בדו&quot;ח זה, אנו מתארים את הפרוטוקולים מעורבים בdfTAסינתזת T ומשלוח סלולארי. כתב היד מתארת ​​כיצד לשלוט בכמות החלבון שנמסר למרחב cytosolic של תאים על ידי שינוי כמות החלבון מנוהלת extracellularly. לבסוף, המגבלות הנוכחיות של הטכנולוגיה החדשה הזו והשלבים כרוכים באימות משלוח הם דנו. הפרוטוקולים תיארו צריכים להיות מאוד שימושיים עבור מבחני מבוססי תאים, כמו גם למניפולצית vivo לשעבר ותכנות מחדש של תאים.

כדי להעריך את ההבדל בין fTAT וdfTAT, תאי הלה מודגרת עבור שעה 1 עם כל פפטיד כדי לקבוע את ההבדל בלוקליזציה הסלולרית שלהם. ההפנמה של שני CPP של הוערכה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. איור 2 מראה כי fTAT (20 מיקרומטר) localizes בהפצת punctate. התפלגות זו עולה בקנה אחד עם פפטיד שנותר ל?...

Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT at JoVE.com

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

משלוח של חלבונים, פפטידים או מולקולות קטנות Cell-חדיר לתאים חיים על ידי דגירה עם Endosomolytic מגיב dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

delivery-proteins-peptides-or-cell-impermeable-small-molecules-into

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K Views.  Texas A&M University. We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky. 

Video: Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

המצאה של אלקטרוכימי-DNA Biosensors לגילוי Reagentless של חומצות, חלבונים ומולקולות קטנות גרעין

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

Live-תא הדמיה של תאים מעבר הבעת חלבונים fluorescently-מתויג מטריקס תלת מימדי

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular choice for drug delivery applications, particularly since it is already FDA-approved for use in humans in the form of resorbable sutures. Hydrophobic and hydrophilic drugs are encapsulated in PLGA particles via single- or double-emulsion. Briefly, the drug is dissolved with polymer or emulsified with polymer in an organic phase that is then emulsified with the aqueous phase. After the solvent has evaporated, particles are washed and collected via centrifugation for lyophilization and long term storage. PLGA degrades slowly via hydrolysis in aqueous environments, and encapsulated agents are released over a period of weeks to months. Although PLGA is a material that possesses many advantages for drug delivery, reproducible formation of nanoparticles can be challenging; considerable variability is introduced by the use of different equipment, reagents batch, and precise method of emulsification. Here, we describe in great detail the formation and characterization of microparticles and nanoparticles formed by single- or double-emulsion using the emulsifying agent vitamin E-TPGS. Particle morphology and size are determined with scanning electron microscopy (SEM). We provide representative SEM images for nanoparticles produced with varying emulsifier concentration, as well as examples of imaging artifacts and failed emulsifications. This protocol can be readily adapted to use alternative emulsifiers (e.g. poly(vinyl alcohol), PVA) or solvents (e.g.&#160;dichloromethane, DCM).

We describe the production and characterization of nanoparticles and microparticles composed of poly(lactic-co-glycolic acid) using vitamin E-TPGS as an emulsifier. By varying formulation parameters such as the concentration of emulsifier, it is possible to produce nanoparticles with mean diameters ranging from 220 nm to&#160;1.98 &#181;m.

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulation של יחיד RNA מולקולות על ידי מלקחיים אופטיים

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers that exist in biological fluids cannot be easily detected with mass spectrometry or immunoassays because they are present in very low concentration, are labile, and are often masked by high-abundance proteins such as albumin or immunoglobulin. Bait containing poly(N-isopropylacrylamide) (NIPAm) based nanoparticles are able to overcome these physiological barriers. In one step they are able to capture, concentrate and preserve biomarkers from body fluids. Low-molecular weight analytes enter the core of the nanoparticle and are captured by different organic chemical dyes, which act as high affinity protein baits. The nanoparticles are able to concentrate the proteins of interest by several orders of magnitude. This concentration factor is sufficient to increase the protein level such that the proteins are within the detection limit of current mass spectrometers, western blotting, and immunoassays. Nanoparticles can be incubated with a plethora of biological fluids and they are able to greatly enrich the concentration of low-molecular weight proteins and peptides while excluding albumin and other high-molecular weight proteins. Our data show that a 10,000 fold amplification in the concentration of a particular analyte can be achieved, enabling mass spectrometry and immunoassays to detect previously undetectable biomarkers.

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

הידרוג&#39;ל Nanoparticle קציר של פלזמה או שתן לגילוי חלבונים שפע נמוך

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors within the medium to control cell behavior. However, soluble additions cannot mimic certain signaling motifs, such as matrix-bound growth factors, cell-cell signaling, and spatial biochemical cues, which are common influences on cells. Furthermore, biophysical properties of the matrix, such as substrate stiffness, play important roles in cell fate, which is not easily manipulated using conventional cell culturing practices. In this method, we describe a straightforward protocol to provide patterned bioactive proteins on synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels using photochemistry. This platform allows for the independent control of substrate stiffness and spatial biochemical cues. These hydrogels can achieve a large range of physiologically relevant stiffness values. Additionally, the surfaces of these hydrogels can be photopatterned with bioactive peptides or proteins via thiol-ene click chemistry reactions. These methods have been optimized to retain protein function after surface immobilization. This is a versatile protocol that can be applied to any protein or peptide of interest to create a variety of patterns. Finally, cells seeded onto the surfaces of these bioactive hydrogels can be monitored over time as they respond to spatially specific signals.

In this method, we use photopolymerization and click chemistry techniques to create protein or peptide patterns on the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels, providing immobilized bioactive signals for the study of cellular responses in vitro.

תכנים חלבונים ביו או פפטידים על הידרוג באמצעות פוטוכימיה עבור יישומים ביולוגיים

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

פיתוח Microfluidic ללמוד את היכולת התארכות של תאי צמחים הגדלים עצה בחללים קטנים מאוד

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all variations are based on the 20 canonical amino acids (cAAs). As a way to introduce additional physicochemical properties into polypeptides, the incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) is increasingly used in protein engineering. Due to their relatively short length, the modification of ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides by ncAAs is particularly attractive. New functionalities and chemical handles can be generated by specific modifications of individual residues. The selective pressure incorporation (SPI) method utilizes auxotrophic host strains that are deprived of an essential amino acid in chemically defined growth media. Several structurally and chemically similar amino acid analogs can then be activated by the corresponding aminoacyl-tRNA synthetase and provide residue-specific cAA(s) &#8594; ncAA(s) substitutions in the target peptide or protein sequence. Although, in the context of the SPI method, ncAAs are also incorporated into the host proteome during the phase of recombinant gene expression, the majority of the cell&#39;s resources are assigned to the expression of the target gene. This enables efficient residue-specific incorporation of ncAAs often accompanied with high amounts of modified target. The presented work describes the in vivo incorporation of six proline analogs into the antimicrobial peptide nisin, a lantibiotic naturally produced by Lactococcus lactis. Antimicrobial properties of nisin can be changed and further expanded during its fermentation and expression in auxotrophic Escherichia coli strains in defined growth media. Thereby, the effects of residue-specific replacement of cAAs with ncAAs can deliver changes in antimicrobial activity and specificity. Antimicrobial activity assays and fluorescence microscopy are used to test the new nisin variants for growth inhibition of a Gram-positive Lactococcus lactis indicator strain. Mass spectroscopy is used to confirm ncAA incorporation in bioactive nisin variants.

The protocol presents the Escherichia coli-based selective pressure incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) into the lactococcal antimicrobial peptide nisin. Its properties can be changed during recombinant expression via substitution with desired ncAAs in defined growth media. Resulting changes in bioactivity are mapped by growth inhibition assays and fluorescence microscopy.

פפטידים מיקרוביאלית המיוצר על ידי ההתאגדות הלחץ הסלקטיבי של חומצות אמינו קאנונית

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different infectious diseases. In this article we demonstrate a method to produce a SAPN core containing a six-helix bundle (SHB) assembly that is capable of presenting antigens in a trimeric conformation. We describe the expression of the SHB-SAPN in an E. coli system, as well as the necessary protein purification steps. We included an isopropanol wash step to reduce the residual bacterial lipopolysaccharide. As an indication of the protein identity and purity, the protein reacted with known monoclonal antibodies in Western blot analyses. After refolding, the size of the particles fell in the expected range (20 to 100 nm), which was confirmed by dynamic light scattering, nanoparticle tracking analysis, and transmission electron microscopy. The methodology described here is optimized for the SHB-SAPN, however, with only slight modifications it can be applied to other SAPN constructs. This method is also easily transferable to large scale production for GMP manufacturing for human vaccines.

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

A detailed method is provided here describing the purification, refolding, and characterization of self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) for use in vaccine development.

ייצור של E. coli-הביע עצמית הרכבה חלקיקי חלבון עבור חיסונים הדורשים Trimeric אפירופה מצגת

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various biological activities including cell proliferation, survival, migration and differentiation. Several aberrations in the FGFR signaling pathway, owing to mutations or gene amplification events, have been identified in various types of cancers. Hence, recent research has focused on developing strategies involving therapeutic targeting of FGFRs. Current FGFR inhibitors at various stages of pre-clinical and clinical development include either small molecule inhibitors of tyrosine kinases or monoclonal antibodies, with only a few peptide- based inhibitors in the pipeline. Here, we provide a protocol using phage display technology to screen small peptides as antagonists of FGFR2. Briefly, a library of phage-displayed peptides was incubated in a plate coated with FGFR2. Subsequently, unbound phage was washed off by TBST (TBS + 0.1% [v/v] Tween-20), and bound phage was eluted with 0.2 M glycine-HCl buffer (pH 2.2). The eluted phage was further amplified and used as input for the next round of biopanning. Following three rounds of biopanning, the peptide sequences of individual phage clones were identified by DNA sequencing. Finally, the screened peptides were synthesized and analyzed for affinity and biological activity.

Herein, we present a detailed protocol for screening small peptides that bind to FGFR2 using a phage display peptide library. We further analyze the affinity of the selected peptides toward FGFR2 in vitro and its ability to suppress cell proliferation.

הקרנה וזיהוי של פפטידים קטנים פילוח הצמיחה פיברוהפיצוץ מקדם Receptor2 באמצעות ספריית Phage התצוגה פפטיד

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...