This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).

1. SPPS: CK TATG סינתזה (TMR) (fTAT) הערה: dfTAT מיוצר בשני שלבים: סינתזה של fTAT מונומר בסינתזה פפטיד השלב מוצקה ואחרי דיסולפיד אג&quot;ח dimerization כדי ליצור dfTAT. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתנפח 500 מ&quot;ג של שרף MBHA אמיד החלקה בdimethylformamide (DMF) בכלי SPPS 50 מיליליטר סטנדרטי עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע deprotection FMOC ידי דוגרים שרף FMOC המוגן בפתרון piperidine 20% (20% בpiperidine DMF, 10 מיליליטר (0.30 mmol). לבצע צעדי deprotection פעמיים (באמצעות 1 x 5 דקות ו 1 x 15 דקות) בצעד כביסה DMF (שלב הכביסה כולל שטיפת השרף מספר פעמים בהיקף כולל של כ 150 מיליליטר של DMF והסרת הממס על ידי סינון ואקום) בין תגובות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנתז CK RKKRRQRRRG (TMR) (fTAT) על שרף MBHA אמיד החלקה. השתמש הבא FMOC מוגן חומצות אמינו: FMOC יס-אה (MTT) (רק בN-סופית), FMOC-ליס (בוק) אה, FMOC-גלאי-OH, FMOC-Arg (PBF) אה, Fmoc- GLN (TRT) אה, וFMOC-Cys (TRT) אה. לבצע את התגובה באמצעות N 2 (20 PSI) כדי להתסיס את התגובה. לבצע את כל התגובות בRT. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע כל תגובת צימוד חומצת אמינו במשך 4 שעות. לכל צימוד, להשתמש FMOC מוגן חומצת אמינו (1.2 mmol), N, N, N &#39;, N&#39; -Tetramethyl- O- (1 H -benzotriazol-1-י.ל) hexafluorophosphate uronium (HBTU) (0.44 גר &#39;, 1.1 mmol ), וdiisopropylethylamine (DIEA) (0.51 מיליליטר, 3.0 mmol) מומס בDMF. בעקבות צימוד 4 שעות, לשטוף את השרף עם DMF ולבצע את צעד deprotection FMOC כמתואר בשלב 1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה עד השרשרת ליניארית פפטיד של fTAT (שרשרת הפפטיד ליניארית: CKRKKRRQRRRG לא TMR) הייתה מסונתזת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן לשטוף ביסודיות באמצעות שרף DMF הראשון והבא שעם dichloromethane (DCM). יש לשטוף את השרף מספר פעמים בהיקף כולל של כ 150 מיליליטר של DMF או DCM ולהסיר את הממס על ידי סינון ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Use MALDI-TOF כדי לאשר שיש פפטיד שהושג משקל המולקולרי הנכון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך תערובת מטריצה ​​על ידי הוספת 1 מ&quot;ג של מטריצה ​​לפתרון המורכב של 50 μl של 0.01% TFA בפתרון מים ו -50 μl של אצטוניטריל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאשר המוני שרשרת הפפטיד ליניארי, להשתמש חומצת α-Cyano-4-hydroxycinnamic. הפעל HPLC אנליטי של פפטיד הגולמי ולאסוף 50 μl מהחלק העליון של השיא הטהור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את המדגם לצלחת על צלחת MALDI: הוסף 8 μl של פפטיד 2 μl של פתרון המטריצה ​​ומניחים על צלחת MALDI לייבוש באוויר או על צלחת חום 37 מעלות צלזיוס. הערה: ארגינין ידוע להיות חומצת אמינו קשה זוג בSPPS. צימוד מוצלח הוקם על ידי ביצוע בדיקת קייזר 14 (מבחן לדוגמא, ninhydrin). בדיקה זו מאפשרת זיהוי של אמינים חופשיים שעלולות להישאר נחק על השרף. במקרה צבע כחול מזוהה (מעיד על הנוכחות של אמינים חופשיים) של צימוד,teps חוזרים. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לCK (-NH-TMR) TATG (fTAT), לדבוק קבוצת הגנת MTT בקבוצת -amino של יס על CK TATG (-NH-MTT) עם פתרון המורכב של 1% חומצת trifluoroacetic (TFA) וtriisopropylsilane 2% (TIS) בDCM. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כהסרה של קבוצת הגנת MTT תביא את המראה של צבע צהוב, דגירה השרף עם 20 מיליליטר של הפתרון מעל 5 דקות, לחזור על זה עד שלא צבע צהוב הוא ציין. לשטוף את השרף עם DCM וDMF שביניהם. בנוסף מאז TIS היא נבלות שהיו ללקט MTT, פעם אחת לא צבע צהוב מופיע בפתרון בנוכחות MTT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף פתרון נוסף עם 1% TFA בDCM (לא TIS) לשרף להבטיח לא יותר MTT הוא שהוסר ונשאר הפתרון ברור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את שלושת מרכיבים: Carboxytetramethylrhodamine (TMR), HBTU, וDIEA (4, 3.9 ו -10 שקילות ביחס לסכום של שרף (במ&quot;ג)) בDMF ולהוסיף את התערובתלשרף ולבצע O התגובה / N באמצעות N היבש 2 לספק תסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות FMOC-deprotection ונטיית חומצת אמינו, לשטוף את השרף עם DCM ולאפשר לו להתייבש. למחשוף של הפפטיד מהשרף שלם, להוסיף תמיסה המכילה 92.5% TFA, 2.5% H 2 O, 2.5%, טופ אימג &#39;, וethanedithiol 2.5% (EDT) (נפח כולל = 4 מיליליטר) לpeptidyl-השרף עבור 3 שעות על RT כדי להשיג deprotection הגלובלי ומחשוף מהשרף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזרז את מוצרי פפטיד הגולמי באמצעות אתר אתיל נטול מים קר (Et 2 O) על ידי ניקוז הפתרון מצעד 1.6 ל -40 מיליליטר של Et 2 O, הספין הזה למטה על 4 מעלות צלזיוס ו4,000 XG למשך 20 - 25 דקות. חזור על שלב זה כדי לאפשר שטיפת המשקע עם נטול מים קרים Et 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend משקעים במים (5 מיליליטר או עד המשקע הוא נמס לגמרי) וLyophilize. אז resuspend המוצרים שהושגו ב0.1% TFA / אצטוניטריל המימי. </li></ol></li> &lt;li&gt; ביצוע ניתוח HPLC עם טור C18 אנליטיות (5 מיקרומטר, 4 x 150 מ&quot;מ) לנתח כל פפטיד. השתמש בקצב זרימה של 1 מיליליטר / דקה, וזיהוי ב214 ננומטר ו -550 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע HPLC למחצה preparative על עמודת 10 x 250 מ&quot;מ C18 לטיהור פפטיד. השתמש בקצב זרימה של 4 מיליליטר / דקה, וזיהוי ב214 ננומטר ו -550 ננומטר. לכל הריצות, להשתמש הדרגתיים ליניארי של 0.1% TFA (ממס) המימי ואצטוניטריל 90%, 9.9% מים, ושל 0.1% TFA (ב ממס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר את הזהות הנכונה של פפטידים על ידי MALDI-TOF פי הפרוטוקול של היצרן: fTAT, מסה צפויה: 2,041.17, מסה נצפתה: 2,040.66. דיק,-K9, צפוי המוני: 1,412.97, נצפה המוני: 1,415.59. השתמש במטריצת חומצת α- cyano-4-hydroxycinnamic לMALDI-TOF. </li></ol> 2. תגובת חמצון: dfTAT דור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאוורר נאגר מלוח פוספט pH (PBS) 7.4 עבור שעה 1 (לפחות 5 מיליליטר לתגובה בהמשך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים fTAT (0.3 מ&quot;ג, 1.5 x 10 -4 mmol) בAERated PBS pH 7.4 (5 מיליליטר). ודא שה- pH הוא בין 7.0-7.5 לאחר התוספת של הפפטיד. אם לא להוסיף נתרן הידרוקסידי (1 M, במרווחים קטנים 1 - 5 μl) להביא את ה- pH חזרה עד 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: החמצן המומס בPBS פועל לחמצן קבוצות תיאול על fTAT וליצור קשר דיסולפיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Nutate O התגובה / N כדי לאפשר לו להגיב עד להשלמה (תשואה של 100% על סמך ניתוח HPLC). לטהר את המוצר באמצעות HPLC ההפוך-שלב ולנתח על ידי ספקטרומטריית מסה (MALDI-TOF) כמו בשלב 1.9. מסה צפויה: 4,080.34, נצפתה המונית: 4,084.21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (X10 0.71 -4 mmol) Lyophilize הטהור dfTAT וגלול במי 200 μl (ריכוז מיקרומטר = 356.3 dfTAT הטהור). </li></ol> 3. מדידת ריכוז dfTAT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend aliquot של dfTAT (μl בדרך כלל 1 בהתאם לכמות של פפטיד המטוהרים) המטוהר ב149 μl של 50 מ&quot;מ פתרון TCEP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: בשלב זה dfTAT מצטמצם מועמית nomer fTAT לחסל את מרווה הספיגה שמתרחשת עקב הקרבה של fluorophore TMR בdfTAT (ε מקדם הכחדה של TMR בdfTAT מופחת בהשוואה לε של TMR בfTAT המופחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר את המדגם כדי להגיב לכ -20 דקות (HPLC אנליטי ניתן להשתמש כדי לאשר הקמת fTAT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את כל הפתרון לקובט קוורץ ולמדוד את הספיגה ב 556 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בחוק של באר (= εcl: ε = 91500 M -1 סנטימטר -1) כדי לחשב את הריכוז של fTAT, לקבוע את הריכוז של dfTAT, ולחלק [fTAT] על ידי שתי. </li></ol> 4. ניסויי משלוח סלולריים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי התאים (הלה, HDF, וכו &#39;.) בצלחת בconfluency של 80 - 90% (לדוגמא, מנה 8 היטב או 24 גם). לגדל תאים במדיום מתאים (למשל, DMEM בתוספת 10% FBS ופן / סטרפטוקוקוס) עד 80 - confluency 90% ב37 מעלות צלזיוסאווירת humidified המכילה 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים שלוש פעמים (3X) עם PBS (על ידי הוספת 200 μl של PBS ולאחר מכן להסיר אותו שלוש פעמים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך ריכוז עובד 5 מיקרומטר של dfTAT על ידי דילול מניות של dfTAT (במים) בNRL-15 תקשורת (ל8 גם לחלק את הנפח הכולל צריך להיות 200 μl). ריכוז של 5 מיקרומטר dfTAT מוביל לאספקה ​​יעילה (רמה גבוהה של משלוח cytosolic בלמעלה מ -90% מתאים הנמצאים בצלחת) ברוב סוגי התאים נבדקו עד כה (איור 3). עם זאת, ריכוזים נמוכים יותר או גבוהים יותר עשויים להיות מתאימים יותר לסוגי תאים עם נטייה גבוהה או נמוכה לחדירה. הערה על אמצעי תקשורת: NRL-15 משמשת למשלוח של dfTAT שכן הוא אינו מכיל ציסטאין אשר יכול להפחית את קשר דיסולפיד בdfTAT. עם זאת, הנתונים שלנו מצביעים על כך ששניהם DMEM הרגיל L-15 (עם ציסטאין) ויכול לשמש כאמצעי תקשורת המשלוח. L-15 מכיל חומצת אמינו ציסטאין הפחתה אבל presumab ציסטאיןly מתחמצן בתקשורת כדי ליצור ציסטין (DMEM הוא ניסח עם ציסטין). dfTAT לכן נותר בשלמותה בתקשורת אלה והמשלוח עובד באותה היעילות כמו שהושג עם nrL15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עם dfTAT (5 מיקרומטר) עם או בלי מטען (למשל., EGFP (10 מיקרומטר)) ולשמור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 (זמן דגירה יכול להיות מופחת אבל dfTAT בדרך כלל דורש כ -30 עד 45 דקות כדי לגרום לדליפת endosomal ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם הפרין (1 מ&quot;ג / מיליליטר) בL-15 (3 שוטף מומלץ) כדי להסיר dfTAT חייב קרום הפלזמה של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עם כתם גרעיני תאים אטומים, למשל., Sytox כחול, ירוק Sytox (2 מיקרומטר בNRL-15), כדי לקבוע אם קרום הפלזמה של תאים נפגעת (תאים מתים יהיו מוכתמים בזמן תאי חיים לא) על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (טבילת שמן 100X או אובייקטיבי 20X). תמונת dfTAT באמצעות מסנן RFP (אקס =560 ± 20 ננומטר / Em = 630 ± 35 ננומטר). הערה: משלוח מוצלח מוביל לקרינה מפוזרת של dfTAT ברחבי התא (הערכת המסירה של חלבון או פפטיד של עניין יהיה תלויה ביישום). הכתמה של nucleoli ידי fTAT (המוצר המופחת של dfTAT עם כניסת cytosolic) יכולה לשמש כאינדיקציה לכך שהקרינה שזוהתה היא תאית. fTAT יהיה לבזות בתוך כמה שעות. בשלב זה, הקרינה של שברי השפלה תופיע כpunctate. זה לא צריך להיות מבולבל להפצת punctate שהוא ראה גם אם dfTAT נשאר לכודה ללא הצלחה בתוך endosomes (זה יכול לקרות אם dfTAT נמצא בנמוך מדי של ריכוז). </li></ol> 5. ריכוז ניהול ושל משרד הפנים נמסר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את הריכוז &quot;משלוח אופטימלי&quot; הנדרש להשגת שחרור cytosolic יעיל של dfTAT בסוג התא בשימוש. בצע מיקרוסקופ פלואורסצנטי על תאים הודגרו עם increasinריכוזי גרם של dfTAT. ריכוז dfTAT האופטימלי מוגדר כריכוז המינימלי שמוביל כדי לנקות cytosolic &quot;לפזר&quot; הקרינה TMR בכ -100% מתאים בתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתנות הריכוז של משרד הפנים בשימוש בפרוטוקול שיתוף דגירה, תוך שמירה על הריכוז של קבוע dfTAT (למשל, באמצעות ריכוז המשלוח האופטימלי של dfTAT). שינוי זמן הדגירה לשעה פחות מ 1 יכול להיות גם אפשרות לשנות את הכמות של משרד הפנים נמסרו. </li></ol>

<ol>
	<li>Didenko, V. V., Ngo, H., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine+as+a+transmembrane+carrier+of+fluorescently+labeled+proteins+and+antibodies.">Polyethyleneimine as a transmembrane carrier of fluorescently labeled proteins and antibodies.</a> Anal Biochem. 344, 168-173 (2005).</li><li>Takeuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+Rapid+Cytosolic+Delivery+Using+Cell-Penetrating+Peptides+Mediated+by+Pyrenebutyrate.">Direct and Rapid Cytosolic Delivery Using Cell-Penetrating Peptides Mediated by Pyrenebutyrate.</a> ACS Chem Biol. 1, 299-303 (2006).</li><li>Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peptide+carrier+for+the+delivery+of+biologically+active+proteins+into+mammalian+cells.">A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells.</a> Nat Biotech. 19, 1173-1176 (2001).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+somatic+cells+via+TAT-mediated+protein+transduction+of+recombinant+factors.">Reprogramming of somatic cells via TAT-mediated protein transduction of recombinant factors.</a> Biomaterials. 33, 5047-5055 (2012).</li><li>Torchilin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+delivery+of+protein+and+peptide+therapeutics.">Intracellular delivery of protein and peptide therapeutics.</a> Drug Discov Today: Technol. 5, e95-e103 (2005).</li><li>Chakravarty, P., Qian, W., El-Sayed, M. A., Prausnitz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+molecules+into+cells+using+carbon+nanoparticles+activated+by+femtosecond+laser+pulses.">Delivery of molecules into cells using carbon nanoparticles activated by femtosecond laser pulses.</a> Nature nanotechnol. 5, 607-611 (2010).</li><li>Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+delivery+using+engineered+virus-like+particles.">Protein delivery using engineered virus-like particles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 16998-17003 (2011).</li><li>Pan, C., Lu, B., Chen, H., Bishop, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+human+fibroblasts+using+HIV-1+TAT+recombinant+proteins+OCT4,+SOX2,+KLF4+and+c-MYC.">Reprogramming human fibroblasts using HIV-1 TAT recombinant proteins OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC.</a> Mol Biol Rep. 37, 2117-2124 (2010).</li><li>Fittipaldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Membrane+Lipid+Rafts+Mediate+Caveolar+Endocytosis+of+HIV-1+Tat+Fusion+Proteins.">Cell Membrane Lipid Rafts Mediate Caveolar Endocytosis of HIV-1 Tat Fusion Proteins.</a> J Biol Chem. 278, 34141-34149 (2003).</li><li>Lee, Y. J., Erazo-Oliveras, A., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+macromolecules+into+live+cells+by+simple+co-incubation+with+a+peptide.">Delivery of macromolecules into live cells by simple co-incubation with a peptide.</a> Chembiochem. 11, 325-330 (2010).</li><li>Angeles-Boza, A. M., Erazo-Oliveras, A., Lee, Y. J., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+endosomolytic+reagents+by+branching+of+cell-penetrating+peptides:+tools+for+the+delivery+of+bioactive+compounds+to+live+cells+in+cis+or+trans.">Generation of endosomolytic reagents by branching of cell-penetrating peptides: tools for the delivery of bioactive compounds to live cells in cis or trans.</a> Bioconjugate chem. 21, 2164-2167 (2010).</li><li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O.">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3185-3190 (2001).</li><li>Erazo-Oliveras, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+delivery+into+live+cells+by+incubation+with+an+endosomolytic+agent.">Protein delivery into live cells by incubation with an endosomolytic agent.</a> Nat methods. 11, 861-867 (2014).</li><li>Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+test+for+detection+of+free+terminal+amino+groups+in+the+solid-phase+synthesis+of+peptides.">Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides.</a> Anal Biochem. 34, 595-598 (1970).</li><li>Muthukrishnan, N., Johnson, G. A., Lim, J., Simanek, E. E., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAT-mediated+photochemical+internalization+results+in+cell+killing+by+causing+the+release+of+calcium+into+the+cytosol+of+cells.">TAT-mediated photochemical internalization results in cell killing by causing the release of calcium into the cytosol of cells.</a> Biochim biophys acta. 1820, 1734-1743 (2012).</li><li>Lautwein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+B+lymphoblastoid+cells+contain+distinct+patterns+of+cathepsin+activity+in+endocytic+compartments+and+regulate+MHC+class+II+transport+in+a+cathepsin+S-independent+manner.">Human B lymphoblastoid cells contain distinct patterns of cathepsin activity in endocytic compartments and regulate MHC class II transport in a cathepsin S-independent manner.</a> J Leukoc Biol. 75, 844-855 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

התאים המשמשים למשלוח dfTAT לא צריך להיות יותר מדי מחוברות (&gt; confluency 90%) מאז זה עשויים להשפיע על יעילות המשלוח. התאים צריכים להיות גם בריאים: תאים מתים בתרבות יכולים לשחרר ברים אפופטוטיים עם שdfTAT יכול לקיים אינטראקציה (לדוגמא, ה- DNA מגרעינים מושפלים). זה בתורו יכול להפר...

<html> המשלוח של חלבונים, פפטידים או מולקולות קטנות תא חדיר לתאים חיים הוא לעתים קרובות רצוי ביישומים רבים ביולוגיים או ביוטכנולוגי (הדמיה סלולרית, מבחני פונקציונליים, תכנות מחדש של תאים, וכו &#39;.) 1-4. גישות משלוח רבות כבר דווחו, כולל microinjection, electroporation, או שימוש בסוכנים מובילים (לדוגמא., פפטידים חודרים תאים כגון TAT, שומנים) 5-7. כל טכניקה יש בדרך כלל יתרונות וחסרונות ספציפיים שעשויה להפוך את הגישות אלה מתאימים ליישומים מסוימים אך לא לאחרים. בעיות נפוצות כרוכות יעילות ירודה משלוח ו / או חוסר שליטה של כמה חומר מועבר 8,9, רעילות או השפעה פיזיולוגית מזיקה 10,11, חוסר שליטה זמנית, משלוח בכמה תאים, אך לא בכל אוכלוסייה (למשל., תוכניות microinjection) 12, ונטייה כימית מורכבת או ניסוח 11. <html> = &quot;Jove_content&quot; של&gt; לאחרונה, פיתחנו אסטרטגית משלוח רומן שעוקפת את המגבלות הללו. אסטרטגיה זו מסתמכת על פפטיד בשם dfTAT (דימר TAT ניאון) 13. dfTAT נגזר מפפטיד חודר התאים היטב יודעים (CPP) TAT. dfTAT מכיל שני עותקי דיסולפיד ערובה של תאת שכותרתו עם tetramethylrhodamine fluorophore. למרות דמיונם, תאת וdfTAT שונה באופן משמעותי בפעילות. תאת מופנמת בדרך כלל לתאים על ידי אנדוציטוזה. זה CPP נשאר עם זאת בעיקר לכוד בתוך endosomes (זה בדרך כלל יוביל להפצת punctate של פפטיד בתוך תאים כאשר נבדקו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי). כמו TAT, dfTAT הוא endocytosed ביעילות על ידי תאים. עם זאת, dfTAT לא להישאר לכוד בתוך endosomes. במקום זאת, הוא מתווך דליפת endosomal באופן שהוא יעיל מאוד. פעילות endosomolytic של dfTAT אז ניתן לנצל כדי לספק מקרומולקולות על ידי assay דגירה פשוט. ntent &quot;&gt; ההבנה הנוכחית של תהליך המשלוח היא כדלקמן. dfTAT גורם macropinocytosis. כתוצאה מכך, התאים הודגרו עם dfTAT לקחת את החלבונים מסיסים, פפטידים, או מולקולות קטנות (מולקולות של עניין, משרד הפנים) נוכחים בתקשורת על ידי נוזל-שלב אנדוציטוזה (ראה איור 1). אינטראקציות בין dfTAT ומשרד הפנים אינן נחוצות עוד שני ישויות התנועה יחד במסלול endocytic. כdfTAT מגיע לסף מסוים בתוך לומן של האברונים endocytic, הוא מבטא פעילות דליפת endosomal (פרטים המולקולריים להישאר להיות מאופיין במלואו). התוכן של לומן של האברונים דולפים, ולכן משרד הפנים, הוא שוחרר לאחר מכן לתאים. גישה זו היא אפוא מאוד נוחה כמו שאף תוכניות נטיה או ניסוח עם משרד הפנים נדרשות. יתר על כן, כי dfTAT הוא לא שינוי ישיר של משרד הפנים, הוא צריך גם לא להפריע לתפקוד MOIs פעם משלוח תאיים מושגת. בנוסף, הריכוזdfTAT משמש משלוח הוא עצמאי מזה של משרד הפנים בתקשורת. לדוגמא, ריכוז dfTAT יכול להישמר מתמיד בין ניסויים שונים כדי להבטיח יעילות לשחזור בדליפת endosomal. לעומת זאת, ריכוז של משרד הפנים בתקשורת ניתן לשנות בהדרגה כדי להשיג רמות רצויות של משרד הפנים נמסרו בcytosol. יעילות דליפת endosomal הגבוהה שהושגה עם dfTAT להפליא מזיקה לרב של התאים שנבדקו עד כה. זו הפתעה כי האברונים endocytic הם מרכיב חשוב של התאים וניתן היה לצפות כי הדליפה הדרמטית בתיווך dfTAT תהיה מלווה תגובות הסלולר מזיקות. עם זאת, תאים שטופלו להתרבות באותו קצב כמו תאים שלא טופלו ולא להציג כל שינוי משמעותי בtranscriptome. יתר על כן, משלוח ניתן לחזור תוך דקות עם יעילות משלוח לשחזור, מצביע על כך שתאים יכולים גם לסבול או להתאושש מתהליך הלידה מבלי לאבדהיכולת שלהם לאנדוציטוזה או דליפת endosomal. תגובות הסלולר עדינות עלולות להתרחש במהלך לידת dfTAT והפרטים המולקולריים של מה התגובות הללו עשויות להיות להישאר כדי להיחקר. ובכל זאת, על ידי שילוב של יעילות גבוהה, נוחות של פרוטוקולים, וחוסר הרעילות, גישת משלוח זה צריכה להוכיח מייד שימושית ביישומים מבוססי תאים רבים. הפרוטוקולים שהוצגו במסמך זה נועדו הפיכת טכנולוגיה זו נגישה לקהילת המחקר.

<table><tbody><tr><td>Heparin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>CAS 9041-08-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Blue</td><td>Invitrogen</td><td>S11348</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Invitrogen</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>nrL15 L-15 (&amp;ndash;) cysteine</td><td>Hyclone</td><td></td><td>Special order</td></tr><tr><td>Fmoc-protected Amino acids</td><td>Novabiochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dfTAT</td><td></td><td></td><td>Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu)</td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted epifluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td>model IXB1</td><td>equipped with a heating stage maintained at 37 &amp;deg;C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C humidified, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

delivery of proteins, peptides or cell-impermeable small molecules into live cells by incubation with the endosomolytic reagent dftat

אסטרטגיות משלוח macromolecular בדרך כלל לנצל את מסלול endocytic כתוואי כניסה סלולרית. עם זאת, מלכוד endosomal מגביל מאוד את היעילות שבה מולקולות גדולות לחדור את מרחב cytosolic של תאים. לאחרונה, יש לנו לעקוף בעיה זו על ידי זיהוי מגיב dfTAT, קשר דיסולפיד דימר של תאת פפטיד שכותרתו עם tetramethylrhodamine fluorophore. יש לנו נוצר דימר כותרתו fluorescently של תאת הטיפוסית פפטיד חודר תאים (CPP), dfTAT, שחודר לתאים חיים, ומגיע לחלל cytosolic של תאים עם יעילות גבוהה במיוחד. משלוח cytosolic של dfTAT מושגת בשורות תאים מרובות, כוללים תאים ראשוניים. יתר על כן, משלוח אינו ניכר להשפיע על כדאיויות תא, התפשטות או ביטוי גנים. dfTAT יכול לספק מולקולות, פפטידים, נוגדנים, אנזימים פעילים ביולוגי קטנים וגורם שעתוק. בדו&quot;ח זה, אנו מתארים את הפרוטוקולים מעורבים בdfTAסינתזת T ומשלוח סלולארי. כתב היד מתארת ​​כיצד לשלוט בכמות החלבון שנמסר למרחב cytosolic של תאים על ידי שינוי כמות החלבון מנוהלת extracellularly. לבסוף, המגבלות הנוכחיות של הטכנולוגיה החדשה הזו והשלבים כרוכים באימות משלוח הם דנו. הפרוטוקולים תיארו צריכים להיות מאוד שימושיים עבור מבחני מבוססי תאים, כמו גם למניפולצית vivo לשעבר ותכנות מחדש של תאים.

כדי להעריך את ההבדל בין fTAT וdfTAT, תאי הלה מודגרת עבור שעה 1 עם כל פפטיד כדי לקבוע את ההבדל בלוקליזציה הסלולרית שלהם. ההפנמה של שני CPP של הוערכה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. איור 2 מראה כי fTAT (20 מיקרומטר) localizes בהפצת punctate. התפלגות זו עולה בקנה אחד עם פפטיד שנותר ל?...

Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT at JoVE.com

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

משלוח של חלבונים, פפטידים או מולקולות קטנות Cell-חדיר לתאים חיים על ידי דגירה עם Endosomolytic מגיב dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

delivery-proteins-peptides-or-cell-impermeable-small-molecules-into

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K Views.  Texas A&M University. We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky. 

Video: Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Physical interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane protein complexes and in dynamic processes such as transmembrane (TM) signaling and regulation of cell-surface protein levels. Understanding the structural features driving the association of particular sequences requires sophisticated biophysical and biochemical analyses of TM peptide complexes. However, the extreme hydrophobicity of TM domains makes them very difficult to manipulate using standard peptide chemistry techniques, and production of suitable study material often proves prohibitively challenging. Identifying conditions under which peptides can adopt stable helical conformations and form complexes spontaneously adds a further level of difficulty. Here we present a procedure for the production of homo- or hetero-dimeric TM peptide complexes from materials that are expressed in E. coli, thus allowing incorporation of stable isotope labels for nuclear magnetic resonance (NMR) or non-natural amino acids for other applications relatively inexpensively. The key innovation in this method is that TM complexes are produced and purified as covalently associated (disulfide-crosslinked) assemblies that can form stable, stoichiometric and homogeneous structures when reconstituted into detergent, lipid or other membrane-mimetic materials. We also present carefully optimized procedures for expression and purification that are equally applicable whether producing single TM domains or crosslinked complexes and provide advice for adapting these methods to new TM sequences.

Biophysical and biochemical studies of interactions among membrane-embedded protein domains face many technical challenges, the first of which is obtaining appropriate study material. This article describes a protocol for producing and purifying disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes that are suitable for structural analysis by solution nuclear magnetic resonance (NMR) and other analytical applications.

מכלולי פפטיד הטרנסממברני ייצור של דיסולפיד-התייצבו ללימודים מבניים

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Chemistry

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

לוחץ תא כחזק, Microfluidic תאית פלטפורמה להצגה

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum (ER) resident proteins implicated in homotypic fusion of the ER. We detail here a method for purifying a glutathione S-transferase (GST) and poly-histidine tagged Drosophila atlastin by two rounds of affinity chromatography. Studying fusion reactions in vitro requires purified fusion proteins to be inserted into a lipid bilayer. Liposomes are ideal model membranes, as lipid composition and size may be adjusted. To this end, we describe a reconstitution method by detergent removal for Drosophila atlastin into preformed liposomes. While several reconstitution methods are available, reconstitution by detergent removal has several advantages that make it suitable for atlastins and other similar proteins. The advantage of this method includes a high reconstitution yield and correct orientation of the reconstituted protein. This method can be extended to other membrane proteins and for other applications that require proteoliposomes. Additionally, we describe a FRET based lipid mixing assay of proteoliposomes used as a measurement of membrane fusion.

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Biological membrane fusion is catalyzed by specialized fusion proteins. Measuring the fusogenic properties of proteins can be achieved by lipid mixing assays. We present a method for purifying recombinant Drosophila atlastin, a protein that mediates homotypic fusion of the ER, reconstituting it to preformed liposomes, and testing for fusion capacity.

כביסה-החוקה בסיוע מחדש של רקומביננטי דרוזולה אטלסטין ליפוזומים בשביל השומנים

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Biochemistry

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. This information is particularly valuable in the context of host-pathogen interactions. Many pathogen proteins function within host cells in a variety of way such as, enabling evasion of the host immune system and survival within the intracellular environment. To study these pathogen-protein host-cell interactions, several approaches are commonly used, including: in vivo infection with a strain expressing a tagged or mutant protein, or introduction of pathogen genes via transfection or transduction. Each of these approaches has advantages and disadvantages. We sought a means to directly introduce exogenous proteins into cells. Electroporation is commonly used to introduce nucleic acids into cells, but has been more rarely applied to proteins although the biophysical basis is exactly the same. A standard electroporator was used to introduce affinity-tagged bacterial effectors into mammalian cells. Human epithelial and mouse macrophage cells were cultured by traditional methods, detached, and placed in 0.4 cm gap electroporation cuvettes with an exogenous bacterial pathogen protein of interest (e.g. Salmonella Typhimurium GtgE). After electroporation (0.3 kV) and a short (4 hr) recovery period, intracellular protein was verified by fluorescently labeling the protein via its affinity tag and examining spatial and temporal distribution by confocal microscopy. The electroporated protein was also shown to be functional inside the cell and capable of correct subcellular trafficking and protein-protein interaction. While the exogenous proteins tended to accumulate on the surface of the cells, the electroporated samples had large increases in intracellular effector concentration relative to incubation alone. The protocol is simple and fast enough to be done in a parallel fashion, allowing for high-throughput characterization of pathogen proteins in host cells including subcellular targeting and function of virulence proteins.

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

Electroporation של effectors בקטריאלי פונקציונלי לתאי יונקים

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Immunology and Infection

Engineering Cell-permeable Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can make use of the translocating ability of so-called cell penetrating peptides (CPPs), also designated as protein transduction domains (PTDs). The TAT-CPP derived from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Tat (trans-activator of transcription) protein has been widely used. The positively charged TAT promotes cell permeability thereby overcoming the barriers of the cellular membrane by endocytosis or/and direct membrane penetration2. In combination with a nuclear localization signal (NLS) fusion proteins are able to enter the nucleus exhibiting functionality. Our video presentation demonstrates, as an exemplification for the engineering of cell-permeable proteins, the construction, production and application of a cell-permeable version of the DNA-modifying enzyme Cre.
Cre is a site-specific recombinase that is able to recognize and recombine 34 base pair loxP sites in mammalian cells in vitro and in vivo. Therefore the Cre/loxP system is widely used to conditionally induce mutations in the genome of living cells3,4. The delivery of active Cre recombinase to cells, however, represents a limitation.
We describe the pSESAME vector system, which allows a direct insertion of the gene-of-interest and provides a platform to rapidly clone different domains and tags used within the vector in a convenient and standardized manner. Rearranging of the different tags has been shown to modify the biochemical properties of the fusion proteins providing a possibility to achieve higher yield and better solubility. We demonstrate how to express and purify recombinant cell-permeant proteins in and from E. coli. The functionality of the recombinant Cre protein is finally validated in cell culture by assessing its intracellular recombinase activity.

Protein transduction enables the direct delivery of biologically active proteins into cells. In contrast to conventional methods such as DNA transfection or viral transduction this non-invasive paradigm allows highly efficient cellular manipulation in a titratable manner circumventing cellular toxicity and the risk of oncogenic transformation by permanent genetic modification.

הנדסה Cell-חדיר חלבון

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can ...

Biology

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1. Many of these are referred to as cell-penetrating peptides, which are frequently noted for their potential as drug delivery vectors1-3. Moreover, there is increasing interest in antimicrobial peptides that operate via non-membrane lytic mechanisms4,5, particularly those that cross bacterial membranes without causing cell lysis and kill cells by interfering with intracellular processes6,7. In fact, authors have increasingly pointed out the relationship between cell-penetrating and antimicrobial peptides1,8. A firm understanding of the process of membrane translocation and the relationship between peptide structure and its ability to translocate requires effective, reproducible assays for translocation. Several groups have proposed methods to measure translocation into large unilamellar lipid vesicles (LUVs)9-13. LUVs serve as useful models for bacterial and eukaryotic cell membranes and are frequently used in peptide fluorescent studies14,15. Here, we describe our application of the method first developed by Matsuzaki and co-workers to consider antimicrobial peptides, such as magainin and buforin II16,17. In addition to providing our protocol for this method, we also present a straightforward approach to data analysis that quantifies translocation ability using this assay. The advantages of this translocation assay compared to others are that it has the potential to provide information about the rate of membrane translocation and does not require the addition of a fluorescent label, which can alter peptide properties18, to tryptophan-containing peptides. Briefly, translocation ability into lipid vesicles is measured as a function of the Foster Resonance Energy Transfer (FRET) between native tryptophan residues and dansyl phosphatidylethanolamine when proteins are associated with the external LUV membrane (Figure 1). Cell-penetrating peptides are cleaved as they encounter uninhibited trypsin encapsulated with the LUVs, leading to disassociation from the LUV membrane and a drop in FRET signal. The drop in FRET signal observed for a translocating peptide is significantly greater than that observed for the same peptide when the LUVs contain both trypsin and trypsin inhibitor, or when a peptide that does not spontaneously cross lipid membranes is exposed to trypsin-containing LUVs. This change in fluorescence provides a direct quantification of peptide translocation over time.

This protocol details a method for the quantitative measure of peptide translocation into large unilamellar lipid vesicles. This method also provides information about the rate of membrane translocation and can be used to identify peptides that efficiently and spontaneously cross lipid bilayers.

מדידת טרנסלוקציה פפטיד לתוך שלפוחית ​​Unilamellar גדול

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

משלוח חלבון ישיר לשימוש בתאי יונקי Cys Cell-חדיר<sub&gt; 2</sub&gt; כלי-<sub&gt; 2</sub&gt; Domains אבץ האצבע

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated exocytosis is fundamental for intercellular communication and is a key mechanism for the secretion of neurotransmitters, hormones, inflammatory mediators, and other compounds, by a variety of cells. At least three distinct mechanisms are known for regulated exocytosis: full exocytosis, where a single SG fully fuses with the plasma membrane, kiss-and-run exocytosis, where a single SG transiently fuses with the plasma membrane, and compound exocytosis, where several SGs fuse with each other, prior to or after SG fusion with the plasma membrane. The type of regulated exocytosis undertaken by a cell is often dictated by the type of secretory trigger. However, in many cells, a single secretory trigger can activate multiple modes of regulated exocytosis simultaneously. Despite their abundance and importance across cell types and species, the mechanisms that determine the different modes of secretion are largely unresolved. One of the main challenges in investigating the different modes of regulated exocytosis, is the difficulty in distinguishing between them as well as exploring them separately. Here we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran as an exocytosis reporter, and live cell imaging, to differentiate between the different pathways of regulated exocytosis, focusing on compound exocytosis, based on the robustness and duration of the exocytic events.

Here we detail a method for live cell imaging of regulated exocytosis. This method utilizes FITC-dextran, which accumulates in lysosome-related organelles, as a reporter. This simple method also allows distinguishing between different modes of regulated exocytosis in cells that are difficult to manipulate genetically.

הדמיה FITC-לתוספי כעיתונאית אקסוציטוזה מוסדר

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

Bead Loading Proteins and Nucleic Acids into Adherent Human Cells

Many live-cell imaging experiments use exogenous particles (e.g., peptides, antibodies, beads) to label or function within cells. However, introducing proteins into a cell across its membrane is difficult. The limited selection of current methods struggles with low efficiency, requires expensive and technically demanding equipment, or functions within narrow parameters. Here, we describe a relatively simple and cost-effective technique for loading DNA, RNA, and proteins into live human cells. Bead loading induces a temporary mechanical disruption to the cell membrane, allowing macromolecules to enter adherent, live mammalian cells. At less than 0.01 USD per experiment, bead loading is the least expensive cell loading method available. Moreover, bead loading does not substantially stress cells or impact their viability or proliferation. This manuscript describes the steps of the bead loading procedure, adaptations, variations, and technical limitations. This methodology is especially suited for live-cell imaging but provides a practical solution for other applications requiring the introduction of proteins, beads, RNA, or plasmids into living, adherent mammalian cells.

Bead loading introduces proteins, plasmids, and particles into adherent mammalian cells. This cell loading technique is inexpensive, rapid, and does not substantially affect cell health. It is best suited for live-cell imaging.

חרוזים טעינת חלבונים וחומצות גרעין לתוך תאים אנושיים חסידים

Many live-cell imaging experiments use exogenous particles (e.g., peptides, antibodies, beads) to label or function within cells. However, introducing ...

Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling, and Macropinocytosis

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase nutrients and other material in cells. The dramatic extension of cell surface ruffles, their closure to form macropinosomes, and the maturation of internalized macropinosomes are key events in this pathway that can be difficult to capture using conventional confocal imaging based on tracking a bolus of fluorescent cargo. Fluorescent dextrans are commonly used experimentally as fluid phase markers for macropinosomes and for other endocytic pathways. A method the lab has adopted to optimize the imaging of dextran uptake involves using live imaging of cells bathed in high concentrations of fluorescent dextran in the medium, with the unlabeled cells appearing in relief (as black). The cell ruffles are highlighted to visualize ruffle closure, and internalized macropinosomes appear as fluorescent vacuoles in the cell interior. This method is optimal for visualizing macropinosome features and allows for easy segmentation and quantification. This paper describes dual-labeling of pathways with different sized dextrans and the co-expression of lipid probes and fluorescent membrane proteins to demark macropinosomes and other endosomes. The detection of internalized dextran at an ultrastructural level using correlative light and electron microscopy (CLEM) is also demonstrated. These cell processes can be imaged using multiple live imaging modalities, including in 3D. Taken together, these approaches optimize macropinosome imaging for many different settings and experimental systems.

<meta charset="utf8"></head><body>פלואורסצנציה חיה, הדמיה הפוכה של סלסול תאים ומקרופינוציטוזיס

This protocol demonstrates dextran imaging in live cells using continuous uptake and inverse images to optimize visualization of ruffling, macropinosome maturation, and analysis of dextran and other cell labelings.

פלואורסצנציה חיה, הדמיה הפוכה של סלסול תאים ומקרופינוציטוזיס

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase ...

משלוח של חלבונים, פפטידים או מולקולות קטנות Cell-חדיר לתאים חיים על ידי דגירה עם Endosomolytic מגיב dfTAT

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מכלולי פפטיד הטרנסממברני ייצור של דיסולפיד-התייצבו ללימודים מבניים

לוחץ תא כחזק, Microfluidic תאית פלטפורמה להצגה

כביסה-החוקה בסיוע מחדש של רקומביננטי דרוזולה אטלסטין ליפוזומים בשביל השומנים

Electroporation של effectors בקטריאלי פונקציונלי לתאי יונקים

הנדסה Cell-חדיר חלבון

מדידת טרנסלוקציה פפטיד לתוך שלפוחית Unilamellar גדול

משלוח חלבון ישיר לשימוש בתאי יונקי Cys Cell-חדיר

הדמיה FITC-לתוספי כעיתונאית אקסוציטוזה מוסדר

חרוזים טעינת חלבונים וחומצות גרעין לתוך תאים אנושיים חסידים

פלואורסצנציה חיה, הדמיה הפוכה של סלסול תאים ומקרופינוציטוזיס

משלוח של חלבונים, פפטידים או מולקולות קטנות Cell-חדיר לתאים חיים על ידי דגירה עם Endosomolytic מגיב dfTAT

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מכלולי פפטיד הטרנסממברני ייצור של דיסולפיד-התייצבו ללימודים מבניים

לוחץ תא כחזק, Microfluidic תאית פלטפורמה להצגה

כביסה-החוקה בסיוע מחדש של רקומביננטי דרוזולה אטלסטין ליפוזומים בשביל השומנים

Electroporation של effectors בקטריאלי פונקציונלי לתאי יונקים

הנדסה Cell-חדיר חלבון

מדידת טרנסלוקציה פפטיד לתוך שלפוחית ​​Unilamellar גדול

משלוח חלבון ישיר לשימוש בתאי יונקי Cys Cell-חדיר

הדמיה FITC-לתוספי כעיתונאית אקסוציטוזה מוסדר

חרוזים טעינת חלבונים וחומצות גרעין לתוך תאים אנושיים חסידים

פלואורסצנציה חיה, הדמיה הפוכה של סלסול תאים ומקרופינוציטוזיס

מדידת טרנסלוקציה פפטיד לתוך שלפוחית Unilamellar גדול