פעילות המחקר של המחברים נתמכים על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות לד&quot;ר אייב (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551).

הפרוטוקולים לעורקים חלקיקים עכבר חלקית קשירת ובידוד של אבי העורקים העכבר ועורק הראש עבור הפנים immunostaining הם מאושרים על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IBT 2014-9231). 1. משמאל חלקית עורק הלב הראשי קשירת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את שטח כירורגי על ידי הנחת 12 אינץ &#39;x 14 אינץ&#39; כרית חימום על השולחן לכסות את הפנקס ואת שולחן הדף עם וילון כירורגי גדול ונקי. התאם את הזרוע של הדום לעמוד כך שדה stereomicroscope של נוף הוא באזור המרכז של כרית חימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את כרית החימום על השולחן ולהגדיר את 3 חיוג בקרת חיוג לרמת החום בינוני. בהגדרת טמפרטורה זו, משטח הלוח הכירורגי (ראה 1.6.1) יהיה 38-40 ° C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כלוב נקי על כרית חימום נוספת. הפעל את כרית חימום על מעל. כלוב זה ישמש להתאוששות לאחר הניתוח (ראה 1.16) וכן דיור. </li></ol></lI <li style=";text-align:right;direction:rtl"> על השולחן הכירורגי, הניחו את שקית עיקור autoclaved המכיל מספריים איריס (זוג אחד), מלקחיים רקמות (1 זוג), מלקחיים אחיזה סופר (2 זוגות), מספריים האביב (1 זוג), מפשק קהה (1 זוג, רוחב 2.5 מ&quot;מ) , עגול מטפל מחזיק מחט (1), מעוקרים 6-0 משי תפר, כותנה היטה applicators, כותנה מיני היטה applicators, וילונות כירורגי, 2 &quot;x 2&quot; גזה ספוגים. גם במקום בקבוק לסחוט המכיל אתנול 70% ועוד המכיל chlorhexidine scrubon כירורגי השולחן כירורגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקלו עכבר. משקל הגוף נדרש כדי לקבוע את הכמות המתאימה של כאבים, אשר ינוהל מיד לפני הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר לתוך החדר אינדוקציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מיכל החמצן ואת מאדה הרדמה כדי להרדים את העכבר בחדר אינדוקציה. לשמור על רמת isoflurane ב 2%. זה לוקח 3-5 דקות לפני העכבר מפסיק לזוז. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד העכבר הוא להיות anestheTized, במקום חתיכה קטנה יותר של סטרילית כירורגי drape (24 אינץ &#39;24 אינץ&#39;) תחת stereomicroscope כדי ליצור משטח כירורגי. לאחר מכן מקום לוח כירורגי אקרילי (אשר נוקה עם אלכוהול 70%) על משטח וילונות. הלוח כירורגי ולכן צריך להיות על כרית חימום אבל מופרדים על ידי שתי שכבות של וילונות כירורגיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר העכבר מפסיק לנוע בחדר אינדוקציה, להעביר את העכבר לאזור הכנה טרום ניתוחי למקם את האף לתוך חרוט האף מחובר מאדה (2% isoflurane). הסר את השיער סביב אזור צוואר הרחם באמצעות גוזם חשמלי או מסיר שיער. אנו ממליצים על הסרת שיער קרם כי שיטה זו לא לייצר חתיכות שיער רופף, אשר קשה להסיר לחלוטין מן האזור כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם חרוט האף במקום, להזיז את העכבר ללוח כירורגית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלטת את כפות הרגליים הימנית והשמאלית אל לוח הניתוח. קלטת את שתי רגליה האחוריותבצד ימין של העכבר. זה גורם סיבוב קל של גוף העכבר כך בצד שמאל של אזור הצוואר של העכבר הופך להיות ממוקם טוב יותר לניתוח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את אזור החתך עם אלכוהול 70%, chlorhexidine לשפשף, ושוב עם אלכוהול 70%. לכסות את העכבר עם וילון כירורגי מעוקרים למעט באזור החתך צוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אישור על ידי קמצוץ הבוהן כי העכבר הוא הרדים לחלוטין לתת כאבים (Caprofen 3-5 מ&quot;ג / ק&quot;ג) באמצעות הזרקה intraperitoneal או תת עורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, לעשות חתך קו האמצע הגחון סביב אזור צוואר הרחם באמצעות או אזמל או מספריים איריס. הערה: אנו משתמשים מספריים כי מרחק העבודה של stereomicroscope מוגבל, מה שהופך אותו קשה להשתמש באזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את עורק הצוואר השמאלי השמאלי (LCCA) על ידי דחיפת הצידה repositioning את בלוטות הרוק המכסים את כלי הדם בצד שמאל שלNimal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות את כל כלי הדם בשדה כירורגי ( איור 1 ). LCCA bifurcates לתוך עורק הצוואר הפנימי השמאלי (ICA) ואת עורק הצוואר החיצוני השמאלי (ECA). עורק התריס שטחי (STA) עולה ECA בצד המדיאלי. עורק העורקים (OA) עולה בדרך כלל מה- ECA, אך בחלק מהעכברים הוא נובע מה- ICA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור את כל ענפי העורק למעט OA באמצעות סטריליזציה 6-0 משי סטרילי. כדי להשיג זאת, להפוך את שתי ligations הבא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בעדינות את רקמת החיבור סביב ומתחת עורק הצוואר הפנימי השמאלי (ICA). לתפוס חתיכת precut 6-0 משי תפר (~ 2.5 ס&quot;מ) עם מלקחיים ולהעביר אותו מתחת לעורק. באמצעות זוג אחר של מלקחיים, למשוך את התפר בערך 1/3 אורכו ולקשור את העורק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את רקמת החיבור סביב עורק הצוואר החיצוני השמאלי (ECA) באותה הדרך שתוארה לעיל ולעשות פרוקסימלי קשירת שמאל thyroi השמאליעורק ד (STA) ( איור 1 ). היזהר לא לפגוע סיבי העצבים הפועלים בתוך שדה כירורגי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ligations אלה נעשו, להחזיר את בלוטות הרוק למצב המקורי להידד את שדה הניתוח על ידי הצבת 2-3 טיפות של מלח סטרילית. סגור את העור באמצעות sucures 6-0 מצופה vericl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הניתוח, במקום את העכבר בכלוב מחומם מראש (ראה 1.2.1). העכבר צריך להתעורר בתוך 5 דקות ולהתחיל להסתובב. לאחר אישר כי העכבר מתנהג בצורה נורמלית, להביא את הכלוב לחדר הדיור בבעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לעכבר במשך 3 הימים הראשונים של ההתאוששות. העכבר יכול להישמר כל עוד הניסוי דורש בתנאים שונים כי פרוטוקול הניסוי קורא. ההכנות פנים יכול להיעשות בכל עת לאחר הניתוח. </li></ol> 2. פנים Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר עם CO 2 על ידי מנת יתר שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">קלטת את העכבר במצב שכיבה (בטן כלפי מעלה) על גבי לוח לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את חלל הבטן על ידי ביצוע חתך קו האמצע באמצעות מספריים איריס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את חלל החזה על ידי חיתוך הצלעות רוחבית לחזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות ניק בתוך קאווה הווריד או לחתוך אחד העורקים הירך עבור ניקוז הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחט 26 G המצורפת ההתקנה זלוף הכבידה (120 ס&quot;מ לחץ מים) לתוך השיא של החדר השמאלי ו perfuse את מערכת הדם עם תמיסת מלח המכיל הפרין (40 U / mL). המשך את זלוף עד מלוחים הזורמים מתוך לחתוך הופך ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את מערכת זלוף מ מלוחים לפתרון קיבעון המכיל paraformaldehyde 4% ב PBS (פוספט שנאגרו מלוחים), ולהמשיך perfusing עבור 5 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר את אבי העורקים ואת שני העורקים הימנית ואת ימין ושמאלי באמצעות מספריים מלקחיים בסוף המלקחיים, ומניחים צינור 50 מ&quot;ל חרוטי המכיל את מקבע על הקרח. </li><li&gt; להעביר את כלי לתוך צלחת פטרי המכיל PBS תחת מיקרוסקופ לנתח, בזהירות להסיר את רקמת השומן החיבור המצורפת העורקים אבי העורקים ואת הצוואר. להפריד ולפצל את העורקים אבי העורקים ואת הצוואר ארוך longitudinally לחשוף את האנדותל ( איור 2 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת כל כלי בנפרד היטב של צלחת 12 גם המכיל 0.5 מ&quot;ל של פתרון permeabilizing (0.1% Triton X-100 ב PBS) לכל טוב. Permeabilize כלי דם במשך 10 דקות עם נדנדה בטמפרטורת החדר (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בקצרה עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחסום אתרים שאינם קשורים ספציפית נוגדן, דגירה כלי הדם בסרום 10% נורמלי מן המין החיה שבה נוגדנים משני נעשו, ב TTBS (טריס שנאגרו מלוחים (TBS) עם 2.5% Tween 20) במשך 30 דקות עם נדנדה ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כלי עם נוגדנים ראשוניים בדילול נאות ב TTBS עם סרום 10% נורמלי (כמתואר לעיל) בן לילה עם נדנדה על 4 מעלות צלזיוס. הרמהשל דילול יש לקבוע עבור כל נוגדנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את מכתים הבקרה הבאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כלי עם TTBS במקום נוגדן ראשוני ואחריו הדגירה עם נוגדנים משני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כלי עם TTBS המכיל לא החיסונית (או מראש החיסון) בסרום או Ig של אותו בעל חיים (מינים) שבו נוגדנים ראשוניים נעשו, ואחריו הדגירה עם נוגדנים משני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשמיט את הדגירה עם נוגדנים משני. דגימות בקרה אלה יש לטפל באותו אופן באותו זמן כאשר מכתים עם נוגדנים ספציפיים מבוצעת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את כלי הדם 3 פעמים עם TTBS במשך 10 דקות כל עם נדנדה ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדנים משני שכותרתו fluorescently מדולל כראוי TTBS עם סרום 10% נורמלי (כמתואר לעיל) במשך 1 שעות עם נדנדה ב RT. מכתים גרעיני עם DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole) עשוי להיות מבוצע בו זמניתT בשלב זה על ידי הוספת 1 / 5,000 על ידי נפח של פתרון מלאי DAPI אשר מכיל 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של DAPI ב H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים עם TTBS במשך 10 דקות כל עם נדנדה ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים בקצרה ב- PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים טיפה אחת של מגיב נגד דהייה על כיסוי זכוכית (22 מ&quot;מ x 50 מ&quot;מ) והניח כלי דם על זכוכית לכסות עם האנדותל מול למטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כוס שקופיות (22 מ&quot;מ x 75 מ&quot;מ) על כלי הדם, תוך הימנעות בועות השמנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופית על מעבדה נקייה לנגב ( למשל Kimwipe) ו לכסות את השקופית עם שתי חתיכות של מעבדה לנגב. בעדינות במקום 3.5 ק&quot;ג של משקל ( למשל, השתמש בקבוק מים על ספר עבה.) על השקופית במשך מקסימום של 5 דקות כדי לשטח את מדגם כלי הדם פנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המשקל ולנגב את פתרון עודף סביב coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל לק ציפור על 4 הפינות של coverslip, במקום שקופיות בתיבת שקופיות, coverslip בצד למעלה, ולשמור בחושך ב RT(או 4 ° C) למשך הלילה. תהליך זה משטחים את הרקמה עוד יותר ומקלה לעשות מיקרוסקופיה בהגדלה גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את coverslip לחלוטין באמצעות לק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע מיקרוסקופיה ברגע לק ציפורן יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת הצורך, שקופיות חנות ב -20 מעלות צלזיוס. </li></ol>

<ol>
	<li>Jelev, L., Surchev, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+simple+technique+for+en+face+endothelial+observations+using+water-soluble+media+-'thinned-wall'+preparations.">A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -'thinned-wall' preparations.</a> J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).</li><li>Neill, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+on+venous+endothelium+of+alterations+in+blood+flow+through+the+vessels+in+vein+walls,+and+the+possible+relation+to+thrombosis.">The effect on venous endothelium of alterations in blood flow through the vessels in vein walls, and the possible relation to thrombosis.</a> Ann Surg. 126 (3), 270-288 (1947).</li><li>Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+examining+the+endothelial+cytoskeleton+in+situ+using+immunofluorescence.">A method for examining the endothelial cytoskeleton in situ using immunofluorescence.</a> J Histochem Cytochem. 11 (11), 1317-1320 (1983).</li><li>Poole, J. C. F., Sanders, A. G., Florey, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regeneration+of+aortic+endothelium.">The regeneration of aortic endothelium.</a> J Pathol Bacteriol. 75, 133-143 (1958).</li><li>Sade, R. M., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=En+face+stripping+of+vascular+endothelium.">En face stripping of vascular endothelium.</a> Microvasc Res. 4, 77-80 (1972).</li><li>White, G. E., Gimbrone, M. A., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+expression+of+stress+fibers+in+vascular+endothelial+cells+in+situ.">Factors influencing the expression of stress fibers in vascular endothelial cells in situ.</a> J Cell Biol. 97 (2), 416-424 (1983).</li><li>Kim, D. W., Gotlieb, A. I., Langille, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+modulation+of+endothelial+F-actin+microfilaments+by+experimental+alterations+in+shear+stress.">In vivo modulation of endothelial F-actin microfilaments by experimental alterations in shear stress.</a> Arteriosclero. 9, 439-445 (1989).</li><li>Haka, A., Potteaux, S., Fraser, H., Randolph, G., Maxfield, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+monocyte+subpopulations+in+murine+atherosclerotic+plaques+by+multiphoton+microscopy.">Quantitative analysis of monocyte subpopulations in murine atherosclerotic plaques by multiphoton microscopy.</a> Plos ONE. 7 (9), 244823e (2012).</li><li>Ch&#232;vre, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+imaging+of+intravascular+atherogenic+inflammation+in+live+mice.">High-Resolution imaging of intravascular atherogenic inflammation in live mice.</a> Circ Res. 114, 770-779 (2014).</li><li>Heo, K. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbed+flow-activated+p90RSK+kinase+accelerates+atherosclerosis+by+inhibiting+SENP2+function.">Disturbed flow-activated p90RSK kinase accelerates atherosclerosis by inhibiting SENP2 function.</a> J Clin Invest. 125 (3), 1299-1310 (2015).</li><li>Le, N. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crucial+role+for+p90RSK-mediated+reduction+of+ERK5+transcriptional+activity+in+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis.">A crucial role for p90RSK-mediated reduction of ERK5 transcriptional activity in endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> Circ. 127, 486-499 (2013).</li><li>Kano, Y., Katoh, K., Masuda, M., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+composition+of+stress+fiber-plasma+membrane+attachment+sites+in+endothelial+cells+in+situ.">Macromolecular composition of stress fiber-plasma membrane attachment sites in endothelial cells in situ.</a> Circ Res. 79, 1000-1006 (1996).</li><li>Nigro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophilin+A+is+an+inflammatory+mediator+that+promotes+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-dependent+mice.">Cyclophilin A is an inflammatory mediator that promotes atherosclerosis in apolipoprotein E-dependent mice.</a> J Exp Med. 208 (1), 53-66 (2011).</li><li>Mattson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+arterial+blood+pressure+in+different+strains+of+mice.">Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice.</a> Am J Hypertens. 14 (5), 405-408 (2001).</li><li>Jinguji, Y., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+fiber+dependent+axial+organization+of+fibronectin+fibrils+in+the+basal+lamina+of+the+chick+and+mesenteric+artery.">Stress fiber dependent axial organization of fibronectin fibrils in the basal lamina of the chick and mesenteric artery.</a> Endothelium. 2, 35-47 (1994).</li><li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Lust, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+tissue+clearing+(PACT):+Technical+evaluations+and+new+perspectives+in+immunofluorescence,+histology,+and+ultrastructure.">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluations and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Sci Rep. 6, 34331 (2016).</li></ol>

אף אחד

כאשר הטיפול בכלי הדם העכבר, חשוב לזכור כי האנדותל הוא שביר וכי כל כוח מכני מוגזם יפגע בתאי אנדותל. לדוגמה, תאים אנדותל לשבור או לנתק מן הקיר כלי אם כלי הוא perfused חזק מדי, אשר יכול לקרות בקלות כאשר vasculature הוא perfused באמצעות מזרק מופעל ביד. <p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rt...

עבור מחקרים היסטופתולוגיים על ידי מיקרוסקופ אור, שלוש חתיכות ממדי של רקמות ביולוגיות מעובדות באופן שגרתי עבור emaffment פרפין ואחריו חתך מכתים. מדגם רקמה כי כבר מוטבע paraffin עשוי להיות כמה מילימטרים בכל שלושת הממדים. עם זאת, לצורך מיקרוסקופ אור, זה חייב להיות מחולק הראשון, כך האור יכול לעבור ולאחר מכן מוכתמים כך בסעיף דק תשואות בניגוד מספיק הדמיה. בגלל דגימות מחולקים הם בדרך כלל 5-10 מיקרומטר עובי, אחד רואה רק חלק קטן מאוד של הדגימה כולה בשני ממדים בכל פעם. ניתן לאסוף סעיפים עוקבים, לאחר הדמיה כל סעיף בנפרד, לבצע שחזור ממוחשב בסיוע של תמונות 3D, אבל זו עבודה מייגעת אכן. Histopathology של כלי הדם, במיוחד לחקר הפתוגנזה של טרשת עורקים, מציג בעיות ייחודיות. טרשת עורקים היא מחלה מתפתחת שמתפתחתבאופן מקומי באזורים בהם מתרחשת זרימת דם מופרעת. יתר על כן, המחלה היא יזמה בתוך האינטימה, רקמה דקה המורכבת monolayer של תאים אנדותל ו מטריקס תאיים, של העורקים הגדולים. מסיבות אלה, זהו אתגר לאתר ולחקור lesions מוקדם באמצעות כלי הדם מחולק כי אחד יכול בקלות להחמיץ חתך את הנגע. גם אם סעיף כולל אזור חולה, אחד יראה רק חלק 5-10 מיקרומטר המכיל תאים אנדותל ותאי קיר כלי דם אחרים בתקשורת adventitia. הר שלם בפנים (המובהק än fäs) ההכנות מאפשרות לנו סקר שטח רחב של משטח כלי הדם כגון האאורטה כולה מן שורש אבי העורקים כל הדרך עד לעורקים השד הנפוצים. באמצעות דוגמה כזו מוכתם נוגדנים ספציפיים ובדיקות ספציפיות אחרות, ניתן לאתר את המיקום של נגעים וגם שם אירועים מולקולריים שונים להתרחש בתאי אנדותל יחד עם wiכמו שינויים בביטוי, בלוקליזציה ושינויים פוסט-טראנסציוניים של חלבונים. בנוסף ללימוד אנתרוגנזה, צורת התא האנדותל שנצפתה בהכנות לפנים משמשת אינדיקטור לתבנית זרימת הדם הממוצעת בזמן. נתונים אלה חשובים ללימוד mechanosignaling של תאים אנדותל באתרם. לשם כך, שגרתית היסטולוגית חתך כלי הדם אינם שימושיים. לכן, עבור רפואה וסקולרית וביולוגיה, חשוב במיוחד לרכוש טכניקה להכנת ההכנות הפנים של כלי הדם המאפשר אחד להתבונן שטח רחב של משטח כלי השיט, כמו גם את אזורים תת קרקעיים עמוק יותר של כלי השיט. כפי שנבדקו על ידי Jelev ו Surchev 1 , ביולוגים כלי הדם פיתחו שיטות שונות כדי לצפות בטנה של כלי הדם על הפנים. כמה שיטות גאוני פותחו בשנות 1940 ו 1950 של. באמצעות שיטות אלה, הם היו<html> מסוגל ללמוד את הארגון הבסיסי של תאים אנדותל כי קו פני השטח הפנימיים של כלי הדם. עם זאת, בגלל הדרך ההכנות האלה מוכנים מוכנים (מה שנקרא שיטת Hautchen 2 , 3 , 4 או קילוף את פני השטח של כלי השיט 5 ) ואת האופן שבו הדגימה היה מוכתם, זה לא תמיד היה ניתן להשיג ללא הפרעה מורפולוגית מידע מכלי השיט אל האזורים העמוקים יותר של דופן כלי הדם. הר שלם בפנים הכנה הכנה בשילוב עם מכתים immunofluorescence אפשרה לנו לא רק ללמוד מורפולוגיה תא האנדותל ביטוי חלבון לוקליזציה בתאים אלה, אלא גם כדי להרחיב מחקרים כאלה לאזור subendothelial של קיר כלי השיט. מחקרים מוקדמים באמצעות ההכנות כלי דם פנים מוכתם immunoflorescently החלו להופיע בשנות ה -1980 של 6 ,F &quot;&gt; 7. עם הופעתו של מיקרוסקופ לייזר סריקת confocal ומיקרוסקופ multiphoton לאחרונה יותר לאחרונה, אחד יכול כעת לקבל תמונות ברורה להתמקד של כלי הדם מבנה הקיר בדגימות כלי רכב מוכתמים immunofluorescently אל פנים, כמו גם את רשת כלי הדם בבעלי חיים חיים 8 , 9 , 10 , 11. אלה מבוססי מחשב טכניקות הדמיה ליצור במיקוד אופטי חתך תמונות, ועל ידי ערימת תמונות כאלה, אפשר לקבל תמונות 3D משוחזרים של קיר כלי הדם ואת רשת כלי הדם ברקמות.בנוסף, אחד יכול ליצור תמונות של קטע שנעשה לאורך ציר ה- Z של התמונה המשוחזרת 12 , 13 . במאמר זה, נוכל להמחיש שיטה להכנת ההכנות פנים של אבי העורקים העכבר ואת עורק הצוואר מכתים אימונופלורסנט. הכנות פניםיכול להתבצע גם לאחר כלי אלה כבר מניפולציה ניסיונית. לדוגמה, עורק הראש יכול להיות ligated חלקית ולאחר מכן הכנה פנים עשה לאחר ניתוח כזה. מסיבה זו, אנו גם לתאר במאמר זה איך אנחנו עושים קשירת חלקית על עורק הצוואר. בהשוואה להכנת תכשירים דומים מחיות גדולות יותר, כגון עכברושים, ארנבות ובני אדם, כלי העכברים קטנים בגודלם ובריריים יותר, מה שדורש טיפול נוסף לטיפול במהלך בידוד כירורגי של כלי הדם והכנתם לצביעת נוגדן ומיקרוסקופ. בגלל המודל החייתי הנפוץ ביותר עבור שינוי גנטי הוא העכבר, זה הופך להיות קריטי עבור חוקרים רבים להתמודד עם כלי העכבר מבלי לפגוע בהם. בכתב יד זה, נתאר כיצד להתמודד עם כלי הדם העכבר בעת ביצוע ההכנות פנים של אבי העורקים בעורק ואת עורק הצוואר. לצורך ההדגמה, נשתמש בעכברי בר C57 / b6.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500ml bag</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9788429</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12556005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 coated vicryl suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J833G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF488 goat anti-rat IgG&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF546 goat anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11035</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD144 (Ve-Cad)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD555289</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG</td>
			<td>Santa Cruze Biotechnology</td>
			<td>Sc-8304</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aoto Flow System</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>EZ-AF9000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave Wrap. 24x24in</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>4024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt retractors, 2.5mm wide</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18200-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caprofen (Rimadyl)&#160;</td>
			<td>zoetis</td>
			<td>NADA#141-199</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine Scrub, 2%</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>RXCHLOR2-PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curity gauze sponges 2x2</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>KC2146</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric heating pad, 12X14</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0667724</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11152-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass 22x50mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393059</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>GS05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Solution 4% in PBS</td>
			<td>Santa Cruze Biotechnology</td>
			<td>SC-281692</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes 100x15mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade mountant with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P-36935</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puritan cortton swabs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10806-005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puritan Mini cotton tipped aplicators</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82004-050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round handled Needle Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12076-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk Suture 6/0</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strabismus Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14075-09</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Grip Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00649-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent Dressing</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>TD-26C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-1000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC327371000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

en face preparation of mouse blood vessels

חלקים של רקמות מוטבע פרפין משמשים באופן שגרתי לחקר היסטולוגיה רקמות היסטופתולוגיה. עם זאת, קשה לקבוע מה מורפולוגיה רקמת תלת מימדי הוא מן הסעיפים האלה. בנוסף, קטעים של רקמות שנבדקו לא יכול להכיל את האזור בתוך הרקמה הדרושה לצורך המחקר המתמשך. הגבלה זו מעכבת מחקרים היסטופאתולוגיים של כלי הדם מאז לפתח נגעים וסקולריים באופן ממוקד. זה דורש שיטה המאפשרת לנו לסקור שטח רחב של קיר כלי הדם, מפני השטח שלו לאזורים עמוקים יותר. הר שלם בפנים הכנה של כלי הדם ממלא דרישה זו. במאמר זה, נוכל להדגים כיצד לעשות ההכנות פנים של אבי העורקים בעורק ואת עורק הצוואר כדי כתם immunofluorescently עבור מיקרוסקופיה confocal וסוגים אחרים של הדמיה מבוססי פלואורסצנטי.

תמונה טיפוסית הפנים immunofluorescence של האנדותל מוצג באיור 3 . תמונה זו מראה קטע אופטי אחד של אבי העורקים של העכבר נלקח ליד פתיחתו של עורק בין דודי (אזור ביצה כהה גדול). אבי העורקים היו מוכתמים פעמיים עם אנטי VE-cadherin (ירוק) ואנטי-VCAM-1 (דלקת תא הידבקות מו...

Watch this Scientific Journal Video about En Face Preparation of Mouse Blood Vessels at JoVE.com

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

נוהל להכנת ההכנות הפנים של העורק הראשי עורקים אבי העורקים מתואר. הכנות כאלה, כאשר מוכתמים immunofluorescently עם נוגדנים ספציפיים, מאפשרים לנו ללמוד לוקליזציה של חלבונים זיהוי של סוגי תאים בתוך הקיר כולו כלי הדם על ידי מיקרוסקופיה confocal.

הכנת פנים של כלי דם עכבר

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...

en-face-preparation-of-mouse-blood-vessels

Research

JoVE Journal

Biology

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

20.8K Views.  University of Texas MD Anderson Cancer Center.  נוהל להכנת ההכנות הפנים של העורק הראשי עורקים אבי העורקים מתואר. הכנות כאלה, כאשר מוכתמים immunofluorescently עם נוגדנים ספציפיים, מאפשרים לנו ללמוד לוקליזציה של חלבונים זיהוי של סוגי תאים בתוך הקיר כולו כלי הדם על ידי מיקרוסקופיה confocal. 

Video: En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

הכנת ניתק תרבויות עכבר קליפתיים Neuron

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

בידוד והתרבות של תאי לבלב הראשיים acinar עכבר

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

כימות יחיד כלי דם קטנים בחדירות מבודדת-perfused דם עכברוש ריאות הכנה

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

Immunofluorescence עקיף על סעיפים קפואים של עכבר בלוטת החלב

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

צמודים זיהוי פנים של Nitric Oxide ו Superoxide ב שכבת האנדותל של העורקים Intact

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

חלבונים Immunofluorescence ניתוח של אנדוגני אקסוגניים centromere-קינטוכור

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on the surface of slides (rather than dropping them from a height), we demonstrate an optimized technique on mouse spermatocytes that was first described in 1997. This method is widely used in laboratories to study mammalian meiosis because it yields a plethora of high quality nuclei undergoing substages of prophase I. Seminiferous tubules are first placed in a hypotonic solution to swell spermatocytes. Then spermatocytes are released into a sucrose solution to create a cell suspension, and nuclei are spread onto fixative-soaked glass slides. Following immunostaining, a diversity of proteins germane to meiotic processes can be examined. For example, proteins of the synaptonemal complex, a tripartite structure that connects the chromosome axes/cores of homologs together can be easily visualized. Meiotic recombination proteins, which are involved in repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination, can also be immunostained to evaluate progression of prophase I. Here we describe and demonstrate in detail a technique widely used to study mammalian meiosis in spermatocytes from juvenile or adult male mice.

Meiosis is the developmental process by which gametes are formed through a single round of DNA replication and two successive rounds of chromosome segregation. Mammalian meiosis can be examined by utilizing a technique to prepare meiotic chromosome spreads. Here, we demonstrate a method of preparing surface-spread nuclei from mouse spermatocytes.

הכנה של כרומוזום Meiotic מתפשטת העכבר Spermatocytes

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

תא הטרנס-הפנימית המוני הזרקה של תאי גזע עובריים מוביל שיעור גבוה יותר של Chimerism

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...