Las actividades de investigación de los autores están respaldadas por donaciones del Instituto Nacional de Salud al Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551).

Los protocolos para la ligación de la arteria carótida parcial de ratón y el aislamiento de la aorta de ratón y la arteria carótida para la inmunotinción en la cara son aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IBT 2014-9231). 1. Ligadura de la arteria carótida parcial izquierda <ol><li> Prepare el espacio quirúrgico colocando una almohadilla calefactora de 12 pulgadas x 14 pulgadas sobre la mesa y cubra la almohadilla y la parte superior de la mesa con un gran paño quirúrgico limpio. Ajuste el brazo del soporte del brazo para que el campo de visión del estereomicroscopio esté en el área central de la almohadilla calefactora. </li><li> Encienda la almohadilla calefactora de la mesa y ajuste el control de 3 posiciones al nivel de calor medio. A esta temperatura, la superficie de la placa quirúrgica (véase 1.6.1) será de 38-40 ° C. <ol><li> Coloque una jaula limpia en otra almohadilla de calefacción. Gire la almohadilla de calefacción como en el caso anterior. Esta jaula se utilizará para la recuperación después de la cirugía (véase 1.16), así como la vivienda. </li></ol></lI&gt; <li> En la mesa quirúrgica, coloque una bolsa de esterilización esterilizada en autoclave que contenga tijeras de iris (1 par), pinzas de tejido (1 par), pinzas de agarre súper (2 pares), tijeras de resorte (1 par) (1), sutura de seda 6-0 esterilizada, aplicadores con punta de algodón, mini aplicadores con punta de algodón, cortinas quirúrgicas y esponjas de gasa de 2 &quot;x 2&quot;. También coloque una botella de compresión que contenga etanol al 70% y otra que contenga clorexidina en la mesa quirúrgica. </li><li> Pesar un ratón. El peso corporal es necesario para determinar la cantidad apropiada de analgesia, que se administrará inmediatamente antes de la cirugía. </li><li> Coloque un ratón en la cámara de inducción. </li><li> Encienda el tanque de oxígeno y el vaporizador anestésico para anestesiar el ratón en la cámara de inducción. Mantener el nivel de isoflurano al 2%. Tarda 3-5 minutos antes de que el ratón deje de moverse. <ol><li> Mientras el ratón está siendo anestesiadoColoque una pieza más pequeña de un paño quirúrgico estéril (24 pulgadas x 24 pulgadas) debajo del microscopio estereoscópico para crear una superficie quirúrgica. A continuación, coloque un tablero de cirugía acrílica (que se ha limpiado con alcohol al 70%) en la superficie cubierta. Por lo tanto, la placa quirúrgica debe estar sobre la almohadilla calefactora pero separada por dos capas de cortinas quirúrgicas. </li></ol></li><li> Cuando el ratón deje de moverse en la cámara de inducción, transfiera el ratón a un área de preparación prequirúrgica y coloque su nariz en el cono nariz conectado al vaporizador (isoflurano al 2%). Retire el cabello alrededor del área cervical con un recortador eléctrico o una loción depilatoria. Se recomienda la eliminación del vello ya que este método no produce piezas de pelo sueltas, que son difíciles de eliminar por completo de la zona quirúrgica. </li><li> Con el cono de la nariz en su lugar, mover el ratón a la placa quirúrgica. <ol><li> Tape hacia abajo las patas delanteras derecha e izquierda en la placa quirúrgica. Tape hacia abajo ambas patas traseras togeEn el lado derecho del ratón. Esto provoca una ligera rotación del cuerpo del ratón de tal manera que el lado izquierdo del área del cuello del ratón se posiciona mejor para la cirugía. </li></ol></li><li> Desinfecte el área de la incisión con alcohol al 70%, exfoliante quirúrgico de clorhexidina y otra vez con alcohol al 70%. Cubra el ratón con un paño quirúrgico esterilizado excepto por el área de la incisión cervical. </li><li> Confirme con un pellizcado que el ratón esté completamente anestesiado y administre analgesia (Caprofen 3-5 mg / kg) mediante inyección intraperitoneal o subcutánea. </li><li> Bajo el microscopio de disección, realice una incisión en la línea media ventral alrededor del área cervical usando un scalpel o tijeras de iris. NOTA: Utilizamos tijeras porque la distancia de trabajo del estereomicroscopio es limitada, lo que dificulta el uso de un bisturí. </li><li> Exponer la arteria carótida común izquierda (LCCA) empujando a un lado y reposicionando las glándulas salivales que cubren los vasos sanguíneos al lado izquierdo de la aNimal </li><li> Identificar todos los vasos sanguíneos en el campo quirúrgico ( Figura 1 ). La LCCA se bifurca en la arteria carótida interna izquierda (ICA) y en la arteria carótida externa izquierda (ECA). La arteria tiroidea superficial (STA) surge de la ECA en el lado medial. La arteria occipital (OA) suele surgir de la ECA, pero en algunos ratones surge de la ICA. </li><li> Ligado todas las ramas de la arteria excepto la OA utilizando sutura de seda esterilizada 6-0. Para lograr esto, realizar las siguientes dos ligaciones. <ol><li> Suavemente retire el tejido conectivo alrededor y debajo de la arteria carótida interna izquierda (ICA). Agarrar un trozo de sutura de seda precortada 6-0 (~ 2,5 cm) con pinzas y pasarlo por debajo de la arteria. Usando otro par de pinzas, tire de la sutura aproximadamente 1/3 de su longitud y ligue la arteria. </li><li> Quitar el tejido conectivo alrededor de la arteria carótida externa izquierda (ECA) de la misma manera descrita anteriormente y hacer una ligadura proximal a la tiroides superior izquierdaD (STA) ( Figura 1 ). Tenga cuidado de no dañar las fibras nerviosas que corren dentro del campo quirúrgico. </li></ol></li><li> Cuando estas ligaduras se han hecho, devolver las glándulas salivales a la posición original e hidratar el campo quirúrgico mediante la colocación de 2-3 gotas de solución salina estéril. Cierre la piel con suturas Vicryl revestidas 6-0. </li><li> Después de la cirugía, coloque el ratón en la jaula precalentada (ver 1.2.1). El ratón debe despertar en 5 minutos y comenzar a caminar. Una vez confirmado que el ratón se comporta normalmente, traiga la jaula a la sala de alojamiento de animales. </li><li> Observe el ratón diariamente durante los primeros 3 días de recuperación. El ratón puede mantenerse mientras el experimento requiera bajo las diversas condiciones que el protocolo experimental requiere. Las preparaciones faciales pueden hacerse en cualquier momento después de la cirugía. </li></ol> 2. En Face Immunostaining <ol><li> Eutanasia un ratón con CO 2 por sobredosis por inhalación. </li><li>Tape el ratón en una posición supina (lado del vientre hacia arriba) en una tabla de disección. </li><li> Exponga la cavidad abdominal haciendo una incisión en la línea media usando tijeras de iris. </li><li> Exponga la cavidad torácica cortando las costillas lateralmente al esternón. </li><li> Hacer un corte en la vena cava o cortar una de las arterias femorales para drenar la sangre. </li><li> Insertar una aguja de 26 G unida a una instalación de perfusión por gravedad (120 cm de presión de agua) en el ápice del ventrículo izquierdo y perfundir el sistema circulatorio con solución salina que contiene heparina (40 U / mL). Continúe la perfusión hasta que la solución salina que sale del corte se vuelva clara. </li><li> Cambiar el sistema de perfusión de solución salina a la solución de fijación que contiene paraformaldehído al 4% en PBS (solución salina tamponada con fosfato) y continuar perfusando durante 5 minutos más. </li><li> Cosecha de la aorta y las arterias carótidas izquierda y derecha utilizando tijeras de extremo romo y fórceps, y colocar en un tubo cónico de 50 ml que contiene el fijador en hielo. </li><li&gt; Transfiera el recipiente a una placa de Petri que contenga PBS bajo un microscopio de disección y retire cuidadosamente la grasa y los tejidos conectivos unidos a la aorta y las arterias carótidas. Separar y dividir la aorta y las arterias carótidas longitudinalmente para exponer el endotelio ( Figura 2 ]. </li><li> Se transfiere cada recipiente por separado a un pocillo de una placa de 12 pocillos que contiene 0,5 ml de una solución permeabilizante (0,1% Triton X-100 en PBS) por pocillo. Permeabilizar los vasos sanguíneos durante 10 min con balanceo a temperatura ambiente (RT). </li><li> Lave brevemente con PBS. </li><li> Para bloquear los sitios de unión a anticuerpos no específicos, incubar los vasos sanguíneos en suero normal al 10% de la especie animal en la que se han hecho los anticuerpos secundarios, en TTBS (solución salina tamponada con Tris (TBS) con Tween 20 al 2,5%) durante 30 minutos con Balanceándose a la RT. </li><li> Incubar los vasos con los anticuerpos primarios debidamente diluidos en TTBS con suero normal al 10% (como se ha descrito anteriormente) durante la noche con balanceo a 4 ° C. El nivelDe dilución debe determinarse para cada anticuerpo. </li><li> Realice la siguiente tinción de control. <ol><li> Incubar los vasos con TTBS en lugar de un anticuerpo primario seguido de incubación con un anticuerpo secundario. </li><li> Incubar los vasos con TTBS que contengan suero no inmune (o preinmunitario) o Ig del mismo animal (especie) en el que se hayan realizado anticuerpos primarios, seguido de incubación con un anticuerpo secundario. </li><li> Omitir la incubación con un anticuerpo secundario. Estas muestras de control deben manipularse de la misma manera y al mismo tiempo cuando se realiza la tinción con anticuerpos específicos. </li></ol></li><li> Lave los vasos sanguíneos 3 veces con TTBS durante 10 minutos cada uno con balanceo a RT. </li><li> Incubar con anticuerpos secundarios marcados fluorescentemente diluidos apropiadamente en TTBS con suero normal al 10% (como se ha descrito anteriormente) durante 1 h con balanceo a RT. La tinción nuclear con DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol) puede realizarse simultáneamente con unT en esta etapa añadiendo 1/5000 en volumen de una solución madre de DAPI que contiene 5 mg / ml de DAPI en H2O. </li><li> Lavar 3 veces con TTBS durante 10 min cada uno con balanceo a RT. </li><li> Enjuague brevemente en PBS. </li><li> Coloque una gota del reactivo anti-fade en un cristal de cubierta (22 mm x 50 mm) y coloque un vaso sanguíneo en el cristal de la cubierta con el endotelio hacia abajo. </li><li> Coloque un cristal de diapositivas (22 mm x 75 mm) en el vaso sanguíneo evitando las burbujas de atrapamiento. </li><li> Coloque la diapositiva en un paño de laboratorio limpio ( por ejemplo, Kimwipe) y cubra la diapositiva con dos piezas de trapo de laboratorio. Coloque suavemente 3,5 kg de peso ( por ejemplo, use una botella de agua en un libro grueso) en la diapositiva durante un máximo de 5 min para aplanar la muestra de vaso sanguíneo en la cara. </li><li> Retire el peso y limpie el exceso de solución alrededor de la cubreobjetos. </li><li> Aplique esmalte de uñas en las 4 esquinas de la cubreobjetos, coloque las diapositivas en una caja de diapositivas, con el lado de la tapa hacia arriba y manténgala en la oscuridad a la RT(O 4ºC) durante la noche. Este proceso aplana el tejido más lejos y hace más fácil hacer la microscopía con aumentos grandes. </li><li> Selle el cubreobjetos completamente usando esmalte de uñas. </li><li> Realizar la microscopía tan pronto como el esmalte de uñas esté seco. </li><li> Si es necesario, guarde los portaobjetos a -20 ° C. </li></ol>

<ol>
	<li>Jelev, L., Surchev, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+simple+technique+for+en+face+endothelial+observations+using+water-soluble+media+-'thinned-wall'+preparations.">A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -'thinned-wall' preparations.</a> J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).</li><li>Neill, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+on+venous+endothelium+of+alterations+in+blood+flow+through+the+vessels+in+vein+walls,+and+the+possible+relation+to+thrombosis.">The effect on venous endothelium of alterations in blood flow through the vessels in vein walls, and the possible relation to thrombosis.</a> Ann Surg. 126 (3), 270-288 (1947).</li><li>Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+examining+the+endothelial+cytoskeleton+in+situ+using+immunofluorescence.">A method for examining the endothelial cytoskeleton in situ using immunofluorescence.</a> J Histochem Cytochem. 11 (11), 1317-1320 (1983).</li><li>Poole, J. C. F., Sanders, A. G., Florey, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regeneration+of+aortic+endothelium.">The regeneration of aortic endothelium.</a> J Pathol Bacteriol. 75, 133-143 (1958).</li><li>Sade, R. M., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=En+face+stripping+of+vascular+endothelium.">En face stripping of vascular endothelium.</a> Microvasc Res. 4, 77-80 (1972).</li><li>White, G. E., Gimbrone, M. A., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+expression+of+stress+fibers+in+vascular+endothelial+cells+in+situ.">Factors influencing the expression of stress fibers in vascular endothelial cells in situ.</a> J Cell Biol. 97 (2), 416-424 (1983).</li><li>Kim, D. W., Gotlieb, A. I., Langille, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+modulation+of+endothelial+F-actin+microfilaments+by+experimental+alterations+in+shear+stress.">In vivo modulation of endothelial F-actin microfilaments by experimental alterations in shear stress.</a> Arteriosclero. 9, 439-445 (1989).</li><li>Haka, A., Potteaux, S., Fraser, H., Randolph, G., Maxfield, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+monocyte+subpopulations+in+murine+atherosclerotic+plaques+by+multiphoton+microscopy.">Quantitative analysis of monocyte subpopulations in murine atherosclerotic plaques by multiphoton microscopy.</a> Plos ONE. 7 (9), 244823e (2012).</li><li>Ch&#232;vre, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+imaging+of+intravascular+atherogenic+inflammation+in+live+mice.">High-Resolution imaging of intravascular atherogenic inflammation in live mice.</a> Circ Res. 114, 770-779 (2014).</li><li>Heo, K. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbed+flow-activated+p90RSK+kinase+accelerates+atherosclerosis+by+inhibiting+SENP2+function.">Disturbed flow-activated p90RSK kinase accelerates atherosclerosis by inhibiting SENP2 function.</a> J Clin Invest. 125 (3), 1299-1310 (2015).</li><li>Le, N. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crucial+role+for+p90RSK-mediated+reduction+of+ERK5+transcriptional+activity+in+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis.">A crucial role for p90RSK-mediated reduction of ERK5 transcriptional activity in endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> Circ. 127, 486-499 (2013).</li><li>Kano, Y., Katoh, K., Masuda, M., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+composition+of+stress+fiber-plasma+membrane+attachment+sites+in+endothelial+cells+in+situ.">Macromolecular composition of stress fiber-plasma membrane attachment sites in endothelial cells in situ.</a> Circ Res. 79, 1000-1006 (1996).</li><li>Nigro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophilin+A+is+an+inflammatory+mediator+that+promotes+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-dependent+mice.">Cyclophilin A is an inflammatory mediator that promotes atherosclerosis in apolipoprotein E-dependent mice.</a> J Exp Med. 208 (1), 53-66 (2011).</li><li>Mattson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+arterial+blood+pressure+in+different+strains+of+mice.">Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice.</a> Am J Hypertens. 14 (5), 405-408 (2001).</li><li>Jinguji, Y., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+fiber+dependent+axial+organization+of+fibronectin+fibrils+in+the+basal+lamina+of+the+chick+and+mesenteric+artery.">Stress fiber dependent axial organization of fibronectin fibrils in the basal lamina of the chick and mesenteric artery.</a> Endothelium. 2, 35-47 (1994).</li><li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Lust, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+tissue+clearing+(PACT):+Technical+evaluations+and+new+perspectives+in+immunofluorescence,+histology,+and+ultrastructure.">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluations and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Sci Rep. 6, 34331 (2016).</li></ol>

Al manejar los vasos sanguíneos del ratón, es importante recordar que el endotelio es frágil y que cualquier fuerza mecánica excesiva dañará las células endoteliales. Por ejemplo, las células endoteliales se rompen o se separan de la pared del vaso si el vaso es perfundido con demasiada fuerza, lo cual puede suceder fácilmente cuando la vasculatura se perfunda usando una jeringa manual. Para obtener una presión de perfusión constante, utilizamos un sistema de perfusión por graved...

Para los estudios histopatológicos por microscopía óptica, se procesan rutinariamente trozos tridimensionales de tejidos biológicos para la incrustación de parafina seguido de seccionamiento y tinción. Una muestra de tejido que ha sido embebida en parafina puede ser varios milímetros en las tres dimensiones. Sin embargo, para el propósito de la microscopía óptica, debe ser primero seccionado de modo que la luz pueda pasar a través y entonces teñido de modo que la sección delgada produzca bastante contraste para la proyección de imagen. Debido a que las muestras seccionadas suelen tener un espesor de 5-10 μm, se ve sólo una fracción muy pequeña de la muestra entera en dos dimensiones a la vez. Es posible recolectar secciones secuenciales y, después de imaginar cada sección individualmente, realizar reconstrucción asistida por computadora de las imágenes 3D, pero esto es un trabajo tedioso. La histopatología de los vasos sanguíneos, especialmente para estudiar la patogénesis de la aterosclerosis, presenta problemas únicos. La aterosclerosis es una enfermedad focalizada que se desarrollaLocalmente en áreas donde se produce un flujo sanguíneo alterado. Además, la enfermedad se inicia dentro de la íntima, un tejido fino que consiste en una monocapa de células endoteliales y matriz extracelular, de grandes arterias. Por estas razones, es un reto localizar y estudiar las lesiones tempranas usando vasos sanguíneos seccionados porque uno puede faltar fácilmente seccionar la lesión. Incluso si una sección incluye un área enferma, se verá sólo una porción de 5-10 μm que contiene células endoteliales y otras células de pared vascular en los medios y adventicia. Las preparaciones de montaje completo en la cara (pronunciado än fäs) nos permiten examinar una amplia área de la superficie del vaso sanguíneo tal como la aorta entera de la raíz aórtica hasta las arterias ilíacas comunes. Utilizando una muestra de este tipo teñida con anticuerpos específicos y otras sondas específicas, se puede señalar la ubicación de las lesiones y también donde varios eventos moleculares se producen en las células endoteliales en conjunción conLa aterogénesis tal como cambios en la expresión, localización y modificaciones postraduccionales de proteínas. Además de estudiar la aterogénesis, la forma de las células endoteliales observada en las preparaciones faciales se utiliza como un indicador del patrón regional de flujo sanguíneo promedio en el tiempo. Tales datos son importantes para estudiar la señalización mecánica de células endoteliales in situ. Para este propósito, los vasos sanguíneos histológicos transversales de corte rutinario no son útiles. Por lo tanto, para la medicina vascular y la biología, es especialmente importante adquirir una técnica para fabricar preparaciones en la cara de los vasos sanguíneos que permite observar una amplia área de la superficie del vaso, así como las áreas subsuperficiales más profundas del vaso. Como revisado por Jelev y Surchev 1 , los biólogos vasculares han desarrollado varios métodos para observar el revestimiento de los vasos sanguíneos en la cara. Algunos métodos ingeniosos se desarrollaron en los años 1940 y 1950. Usando estos métodos, fueron<html> Capaz de estudiar la organización fundamental de las células endoteliales que recubren la superficie interna de los vasos sanguíneos. Sin embargo, debido a la forma en que se preparan estas preparaciones de en-face (el denominado método de Hautchen 2 , 3 , 4 o desprendimiento de la superficie del recipiente 5 ) y la forma en que se tiñe la muestra, no siempre fue posible obtener muestras morfológicas ininterrumpidas Información de la superficie del vaso en las áreas más profundas de la pared de los vasos sanguíneos. La preparación completa de vasos enmarcados combinados con tinción por inmunofluorescencia nos permitió no sólo estudiar la morfología de las células endoteliales y la expresión y localización de proteínas en estas células, sino también extender dichos estudios a la región subendotelial de la pared del vaso. Los primeros estudios que usaban vasos sanguíneos en preparados para la cara manchados con inmunofluorescencia empezaron a aparecer en los años ochenta 6 ,Con el advenimiento de la microscopía confocal de barrido láser y más recientemente la microscopía multifotónica, ahora se pueden obtener imágenes claras en foco de la estructura de la pared de los vasos sanguíneos en muestras de vasos endoblados con inmunofluorescencia así como la red vascular en animales vivos 8 , 9 , 10 , 11. Estas técnicas de formación de imágenes basadas en ordenador crean imágenes seccionadas ópticamente en foco y, apilando dichas imágenes, se pueden obtener imágenes tridimensionales reconstruidas de la pared del vaso y de la red vascular en los tejidos. Puede generar imágenes de una sección hecha a lo largo del eje Z de la imagen reconstruida 12 , 13 . En este artículo, ilustraremos un método para preparar preparaciones en la cara de la aorta de ratón y la arteria carótida para tinción inmunofluorescente. Preparaciones para el rostroPueden hacerse incluso después de que estos vasos hayan sido manipulados experimentalmente. Por ejemplo, una arteria carótida puede ser parcialmente ligada y después una preparación de cara preparada después de tal cirugía. Por esta razón, también describiremos en este artículo cómo realizamos una ligadura parcial en la arteria carótida. En comparación con la fabricación de preparaciones similares de animales más grandes tales como ratas, conejos y seres humanos, los vasos de ratón son de pequeño tamaño y más frágiles, requiriendo así un cuidado adicional durante el aislamiento quirúrgico de los vasos y preparándolos para la tinción de anticuerpos y la microscopía. Debido a que el modelo animal más utilizado para la modificación genética es el ratón, resulta crítico que muchos investigadores manejen los vasos de ratón sin dañarlos. En este manuscrito, vamos a describir cómo manejar los vasos sanguíneos del ratón cuando se hacen preparaciones en la cara de la aorta del ratón y la arteria carótida. Para fines de demostración, se utilizarán ratones C57 / b6 de tipo salvaje.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500ml bag</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9788429</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12556005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 coated vicryl suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J833G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF488 goat anti-rat IgG&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF546 goat anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11035</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD144 (Ve-Cad)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD555289</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG</td>
			<td>Santa Cruze Biotechnology</td>
			<td>Sc-8304</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aoto Flow System</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>EZ-AF9000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave Wrap. 24x24in</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>4024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt retractors, 2.5mm wide</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18200-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caprofen (Rimadyl)&#160;</td>
			<td>zoetis</td>
			<td>NADA#141-199</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine Scrub, 2%</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>RXCHLOR2-PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curity gauze sponges 2x2</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>KC2146</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric heating pad, 12X14</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0667724</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11152-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass 22x50mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393059</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>GS05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Solution 4% in PBS</td>
			<td>Santa Cruze Biotechnology</td>
			<td>SC-281692</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes 100x15mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade mountant with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P-36935</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puritan cortton swabs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10806-005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puritan Mini cotton tipped aplicators</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82004-050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round handled Needle Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12076-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk Suture 6/0</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strabismus Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14075-09</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Grip Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00649-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent Dressing</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>TD-26C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-1000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC327371000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

en face preparation of mouse blood vessels

Secciones de los tejidos embebidos en parafina se utilizan habitualmente para el estudio de histología de tejidos e histopatología. Sin embargo, es difícil determinar cuál es la morfología tridimensional del tejido de tales secciones. Además, las secciones de los tejidos examinados pueden no contener la región dentro del tejido que sea necesaria para el propósito del estudio en curso. Esta última limitación obstaculiza los estudios histopatológicos de los vasos sanguíneos ya que las lesiones vasculares se desarrollan de manera focalizada. Esto requiere un método que nos permita examinar una amplia área de la pared de los vasos sanguíneos, desde su superficie hasta regiones más profundas. Todo un montaje en la cara preparación de los vasos sanguíneos cumple con este requisito. En este artículo, vamos a demostrar cómo hacer preparaciones en la cara de la aorta del ratón y la arteria carótida y inmunofluorescentemente mancha para la microscopía confocal y otros tipos de imágenes basadas en fluorescencia.

En la Figura 3 se muestra una imagen típica de inmunofluorescencia en cara del endotelio. Esta imagen muestra una única sección óptica de una aorta del ratón tomada cerca de la abertura de una arteria intercostal (el área oscura grande en forma de huevo). La aorta se tiñó doblemente con anti-VE-cadherina (verde) y anti-VCAM-1 (molécula de adhesión celular vascular-1) (rojo). Cada célula endotelial se delinea con una tinción lineal verde en la unión de adhere...

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En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

Se describe un procedimiento para preparar preparaciones en la cara de la arteria carótida de ratón y la aorta. Tales preparaciones, cuando se tiñen inmunofluorescentemente con anticuerpos específicos, nos permiten estudiar la localización de proteínas y la identificación de tipos de células dentro de toda la pared vascular por microscopía confocal.

En Face Preparación de los vasos sanguíneos del ratón

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

20.8K vistas.  University of Texas MD Anderson Cancer Center.  Se describe un procedimiento para preparar preparaciones en la cara de la arteria carótida de ratón y la aorta. Tales preparaciones, cuando se tiñen inmunofluorescentemente con anticuerpos específicos, nos permiten estudiar la localización de proteínas y la identificación de tipos de células dentro de toda la pared vascular por microscopía confocal. 

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Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Preparación de los cultivos disociados ratón neuronas corticales

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Investigación

Biología

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

En vivo de imágenes y tratamientos terapéuticos en un modelo de ratón ortotópico de cáncer de ovario

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Aislamiento y cultivo de células endoteliales pulmonares de ratones recién nacidos

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Aislamiento y cultivo de ratón primarias células acinares pancreáticas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

La cuantificación individual Microvessel Permeabilidad en aislado de rata Blood-perfundido Preparación de pulmón

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

Inmunofluorescencia indirecta en secciones congeladas de ratón Glándula Mamaria

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

En Detección de la cara del óxido nítrico y superóxido en la capa endotelial de las arterias intactas

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

Las proteínas Análisis de inmunofluorescencia de endógenos y exógenos Centrómero-cinetocoro

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on the surface of slides (rather than dropping them from a height), we demonstrate an optimized technique on mouse spermatocytes that was first described in 1997. This method is widely used in laboratories to study mammalian meiosis because it yields a plethora of high quality nuclei undergoing substages of prophase I. Seminiferous tubules are first placed in a hypotonic solution to swell spermatocytes. Then spermatocytes are released into a sucrose solution to create a cell suspension, and nuclei are spread onto fixative-soaked glass slides. Following immunostaining, a diversity of proteins germane to meiotic processes can be examined. For example, proteins of the synaptonemal complex, a tripartite structure that connects the chromosome axes/cores of homologs together can be easily visualized. Meiotic recombination proteins, which are involved in repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination, can also be immunostained to evaluate progression of prophase I. Here we describe and demonstrate in detail a technique widely used to study mammalian meiosis in spermatocytes from juvenile or adult male mice.

Meiosis is the developmental process by which gametes are formed through a single round of DNA replication and two successive rounds of chromosome segregation. Mammalian meiosis can be examined by utilizing a technique to prepare meiotic chromosome spreads. Here, we demonstrate a method of preparing surface-spread nuclei from mouse spermatocytes.

Preparación del cromosoma meiótico se extiende desde ratón espermatocitos

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-interno celular masiva inyección de células madre embrionarias conduce a mayores tasas de quimerismo

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...