Name: en face preparation of mouse blood vessels
Uploaded: 2017-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
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Le attività di ricerca degli autori sono sostenute da sovvenzioni dell&#39;Istituto Nazionale di Salute al Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551).

I protocolli per la legatura parziale dell&#39;arteria carotide del mouse e l&#39;isolamento dell&#39;arte del topo e dell&#39;arteria carotide per l&#39;immunocoltura del viso sono approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l&#39;uso degli animali (IBT 2014-9231). 1. Ligation di arteria carotide parziale sinistra <ol><li> Preparare lo spazio chirurgico mettendo un tavoletta da 12 pollici da 14 pollici sul tavolo e coprire il tappetino e la tavola con un grande teli chirurgici puliti. Regolare il braccio del basamento del braccio in modo che il campo visivo dello stereomicroscopio sia nell&#39;area centrale del piano di riscaldamento. </li><li> Accendere il riscaldatore sul tavolo e impostare la ghiera di controllo a 3 livelli al livello di calore medio. A questa impostazione della temperatura, la superficie della scheda chirurgica (vedi 1.6.1) sarà di 38-40 ° C. <ol><li> Mettere una gabbia pulita su un altro tappetino. Ruotare il riscaldamento come sopra. Questa gabbia sarà utilizzata per il recupero dopo l&#39;intervento chirurgico (vedi 1.16) e l&#39;alloggiamento. </li></ol></li&gt; <li> Sul tavolo chirurgico inserire una sacca per sterilizzazione autoclavata contenente forbici iride (1 paio), pinze per tessuti (1 coppia), pinze super grip (2 paia), forbici a molla (1 coppia), retrattore sbattuto (1 coppia, larghezza 2,5 mm) (1), sutura di seta sterilizzata 6-0, applicatori a cotone, applicatori in miniatura di cotone, drappi chirurgici e 2 spugne di garze da 2 &quot;x 2&quot;. Inoltre mettere una bottiglia di spremitura contenente il 70% di etanolo e un altro contenente cherheidina chirurgica chirurgica il tavolo chirurgico. </li><li> Pesare un mouse. Il peso corporeo è necessario per determinare l&#39;adeguata quantità di analgesia, che verrà somministrata immediatamente prima dell&#39;intervento. </li><li> Inserire un mouse nella camera di induzione. </li><li> Accendere il serbatoio dell&#39;ossigeno e il vaporizzatore anestetico per anestetizzare il topo nella camera di induzione. Mantenere il livello di isoflurano al 2%. Ci vogliono 3-5 minuti prima che il mouse smetta di muoversi. <ol><li> Mentre il mouse è in anestesia, Mettere un piccolo pezzo di sterile chirurgico (24 pollici x 24 pollici) sotto lo stereomicroscopio per creare una superficie chirurgica. Quindi posizionare una tavola chirurgica acrilica (che è stata pulita con alcol al 70%) sulla superficie drappeggiata. La tavola chirurgica dovrebbe quindi essere sul piano di riscaldamento, ma separata da due strati di teli chirurgici. </li></ol></li><li> Quando il topo smette di muoversi nella camera di induzione, trasferire il mouse in un&#39;area di preparazione pre-chirurgica e posizionare il naso nel cono conico collegato al vaporizzatore (2% isoflurano). Rimuovi i capelli intorno all&#39;area cervicale usando un trimmer elettrico o una lozione rimozione dei capelli. Raccomandiamo la rimozione dei capelli perché questo metodo non produrrà pezzi di capelli allentati, che sono difficili da rimuovere completamente dall&#39;area chirurgica. </li><li> Con il cono in posizione, spostare il mouse sulla scheda chirurgica. <ol><li> Tape giù le zampe anteriori destra e sinistra alla scheda chirurgica. Tape giù entrambe le gambe posterioriSul lato destro del mouse. Ciò provoca una leggera rotazione del corpo del topo in modo tale che il lato sinistro dell&#39;area del collo del mouse diventa meglio posizionato per la chirurgia. </li></ol></li><li> Disinfettare l&#39;area di incisione con l&#39;alcool al 70%, la chirurgia cherheidina, e ancora con l&#39;alcool al 70%. Coprire il mouse con un drappo chirurgico sterilizzato tranne per l&#39;area di incisione cervicale. </li><li> Confermare con il pizzico del piede che il mouse è completamente anestetizzato e dare analgesia (Caprofen 3-5 mg / kg) tramite iniezione intraperitoneale o sottocutanea. </li><li> Sotto il microscopio di dissezione, effettuare un&#39;incisione midline ventrale attorno all&#39;area cervicale usando una forbice da scalpello o da iride. NOTA: usiamo forbici perché la distanza di lavoro dello stereomicroscopio è limitata, rendendo difficile l&#39;uso di un bisturi. </li><li> Esporre l&#39;arteria carotide comune sinistra (LCCA) spingendo da parte e riposizionando le ghiandole salivari che coprono i vasi sanguigni sul lato sinistro dellaNimal. </li><li> Identificare tutti i vasi sanguigni nel campo chirurgico ( Figura 1 ). L&#39;LCCA si biforcera nell&#39;arteria carotide interna sinistra (ICA) e nell&#39;arteria carotide esterna sinistra (ECA). L&#39;arteria tiroidea superficiale (STA) nasce dall&#39;ECA dal lato mediale. L&#39;arteria occipitale (OA) di solito sorge dalla ECA, ma in alcuni topi deriva dall&#39;ICA. </li><li> Legare tutti i rami d&#39;arteria tranne l&#39;OA usando la sutura di seta sterilizzata 6-0. Per raggiungere questo obiettivo, fare le due seguenti legazioni. <ol><li> Rimuovere delicatamente il tessuto connettivo attorno e sotto l&#39;arteria carotide interna sinistra (ICA). Prendi un pezzo di sutura di seta 6-0 (~ 2,5 cm) con le pinze e lo passa sotto l&#39;arteria. Utilizzando un&#39;altra coppia di pinze, tirare la sutura circa 1/3 della sua lunghezza e legare l&#39;arteria. </li><li> Rimuovere il tessuto connettivo attorno all&#39;arteria carotide esterna sinistra (ECA) allo stesso modo sopra descritto e fare una legatura prossimale al tiro superiore superiore sinistroD arteria (STA) ( figura 1 ). Fare attenzione a non danneggiare le fibre nervose che corrono all&#39;interno del campo chirurgico. </li></ol></li><li> Quando queste legazioni sono state fatte, riportare le ghiandole salivari nella posizione originale e idratare il campo chirurgico collocando 2-3 gocce di salina sterile. Chiudere la pelle usando le suture con vernice 6-0 rivestite. </li><li> Dopo l&#39;intervento, posizionare il mouse nella gabbia pre-riscaldata (vedere 1.2.1). Il mouse dovrebbe svegliarsi entro 5 minuti e cominciare a camminare. Una volta confermato che il mouse si comporta normalmente, portare la gabbia nella stanza di alloggiamento animale. </li><li> Osservare il mouse ogni giorno per i primi 3 giorni di recupero. Il mouse può essere mantenuto fino a quando l&#39;esperimento richiede le varie condizioni richieste dal protocollo sperimentale. Le preparazioni in faccia possono essere fatte in qualsiasi momento dopo l&#39;intervento chirurgico. </li></ol> 2. En Face Immunostaining <ol><li> Eutanizzare un topo con CO 2 per overdose di inalazione. </li><li>Nastro il mouse in posizione supina (pancia verso l&#39;alto) su una scheda di dissezione. </li><li> Esporre la cavità addominale facendo un&#39;incisione midline usando le forbici dell&#39;iride. </li><li> Esporre la cavità toracica tagliando le nervature lateralmente allo sterno. </li><li> Fare un nick nella vena cava o tagliare una delle arterie femorali per scaricare il sangue. </li><li> Inserire un ago da 26 G attaccato ad una configurazione di gravità (120 cm di pressione dell&#39;acqua) nell&#39;apice del ventricolo sinistro e perfezionare il sistema circolatorio con soluzione salina contenente eparina (40 U / mL). Continuare la perfusione fino a quando la salina che scorre dal taglio diventa chiara. </li><li> Passare il sistema di perfusione dalla soluzione salina alla soluzione di fissazione contenente 4% di paraformaldeide in PBS (salina tampone fosfato) e continuare a perfusione per altri 5 min. </li><li> Raccogliere l&#39;aorta e le arterie carotide sinistra e destra usando forbici e pinze a punta liscia e collocare in un tubo conico da 50 mL contenente il fissativo sul ghiaccio. </li><li&gt; Trasferire la vaschetta in un piatto di Petri contenente PBS sotto un microscopio di dissezione e rimuovere con cura i tessuti connettivi e legati all&#39;arte e alle arterie carotide. Separare e suddividere l&#39;aorta e le arterie carotide longitudinalmente per esporre l&#39;endotelio ( Figura 2 ). </li><li> Trasferire separatamente ciascuna vasca in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti contenente 0,5 mL di una soluzione permeabilizzante (0,1% Triton X-100 in PBS) per pozzetto. Permeabilizzare i vasi sanguigni per 10 minuti con il dondolo a temperatura ambiente (RT). </li><li> Lavare brevemente con PBS. </li><li> Per bloccare i siti di legame non specifici dell&#39;anticorpo, incubare i vasi sanguigni nel 10% di siero normale della specie animale in cui sono stati prodotti gli anticorpi secondari, in TTBS (Tris-tamponato salina (TBS) con 2,5% Tween 20) per 30 minuti con Dondolando a RT. </li><li> Incubare le vasi con gli anticorpi primari opportunamente diluiti in TTBS con 10% di siero normale (come sopra descritto) durante la notte con il dondolo a 4 ° C. Il livelloDi diluizione deve essere determinato per ogni anticorpo. </li><li> Eseguire la seguente colorazione di controllo. <ol><li> Incubare le vasi con TTBS anziché un anticorpo primario seguito da incubazione con un anticorpo secondario. </li><li> Incubare le navi con TTBS contenenti siero o immunogeno non immunitario (o pre-immunitario) dello stesso animale (specie) in cui sono stati effettuati anticorpi primari, seguiti da incubazione con un anticorpo secondario. </li><li> Omettere l&#39;incubazione con un anticorpo secondario. Questi esemplari di controllo devono essere trattati nello stesso modo e nello stesso tempo in cui viene eseguita la colorazione con anticorpi specifici. </li></ol></li><li> Lavare i vasi sanguigni 3 volte con TTBS per 10 minuti ciascuno con il dondolo a RT. </li><li> Incubare con anticorpi secondari a fluorescenza diluiti opportunamente in TTBS con 10% di siero normale (come sopra descritto) per 1 h con il dondolo a RT. La colorazione nucleare con DAPI (4 &#39;, 6-diammino-2-fenilindolo) può essere eseguita simultaneamenteT questa fase aggiungendo 1/5000 in volume di una soluzione di riserva DAPI che contiene 5 mg / mL di DAPI in H 2 O. </li><li> Lavare 3 volte con TTBS per 10 minuti ciascuno con il dondolo a RT. </li><li> Sciacquare brevemente in PBS. </li><li> Mettere una goccia del reagente antifumo su un vetro di copertura (22 mm x 50 mm) e posizionare un vaso sanguigno sul vetro di copertura con l&#39;endotelio rivolto verso il basso. </li><li> Posizionare un vetrino (22 mm x 75 mm) sul vaso sanguigno evitando le bolle di cattura. </li><li> Posizionare la diapositiva su una pulizia pulita del laboratorio ( es. Kimwipe) e coprire la diapositiva con due pezzi di pulizia del laboratorio. Mettere delicatamente 3,5 kg di peso ( ad es. Usare una bottiglia d&#39;acqua su un libro spesso) sullo scivolo per un massimo di 5 minuti per appiattire il campione del vaso sanguigno. </li><li> Rimuovere il peso e togliere la soluzione in eccesso da tutto il coperchio. </li><li> Applicare uno smalto ai 4 angoli della copertura, posizionare le diapositive in una scatola di scorrimento, rivestimento rivolto verso l&#39;alto e tenere al buio a RT(O 4 ° C) durante la notte. Questo processo appiattisce ulteriormente il tessuto e rende più facile eseguire la microscopia ad alti ingrandimenti. </li><li> Sigillare completamente il coperchio con smalto. </li><li> Eseguire la microscopia non appena il lucido per unghie è asciutto. </li><li> Se necessario, conservare le diapositive a -20 ° C. </li></ol>

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Quando si manipolano con i vasi sanguigni del mouse, è importante ricordare che l&#39;endotelio è fragile e che qualsiasi eccessiva forza meccanica danneggerà le cellule endoteliali. Ad esempio, le cellule endoteliali si rompono o si staccano dalla parete del vaso se la vasca viene perfusa troppo forte, cosa che può accadere facilmente quando la vasculatura viene perfusa usando una siringa a mano. Per ottenere una pressione costante di perfusione, usiamo un sistema di perfusione gravitaz...

Per gli studi istopatologici mediante microscopia leggera, i pezzi tridimensionali di tessuti biologici sono trattati in modo ordinario per l&#39;embedment di paraffina seguito da sezionamento e colorazione. Un campione di tessuto che è stato incorporato in paraffina può essere di parecchi millimetri in tutte e tre le dimensioni. Tuttavia, ai fini della microscopia leggera, deve essere prima sezionato in modo che la luce possa passare e poi venire macchiata in modo che la sezione sottile abbia abbastanza contrasto per l&#39;imaging. Poiché gli esemplari tagliati sono di solito 5-10 μm di spessore, si vede solo una frazione molto piccola dell&#39;intero campione in due dimensioni alla volta. È possibile raccogliere sezioni sequenziali e, dopo l&#39;imaging di ogni sezione singolarmente, eseguire la ricostruzione assistita da computer delle immagini 3D, ma in realtà è un lavoro noioso. L&#39;istopatologia dei vasi sanguigni, specialmente per studiare la patogenesi dell&#39;aterosclerosi, presenta problemi unici. L&#39;aterosclerosi è una malattia focalizzata che si sviluppaLocalmente in aree dove si verifica un flusso sanguigno disturbato. Inoltre, la malattia è iniziata nell&#39;intima, un tessuto sottile costituito da un monostrato di cellule endoteliali e matrice extracellulare, di grandi arterie. Per queste ragioni, è una sfida per individuare e studiare le lesioni precoci utilizzando vasi sanguigni sezionati perché si può facilmente perdere la sezione della lesione. Anche se una sezione comprende un&#39;area malata, si vedrà solo una porzione di 5-10 μm contenente cellule endoteliali e altre cellule della parete vascolare nei media e nell&#39;adventitia. Il tutto in faccia (pronunciato än fäs) i preparativi ci permettono di esaminare un&#39;ampia area della superficie del vaso sanguigno come l&#39;intero aorta dalla radice aortica fino alla comune arteria iliaca. Utilizzando un simile campione colorato con anticorpi specifici e altre sonde specifiche, si può individuare la localizzazione delle lesioni e anche dove si verificano vari eventi molecolari nelle cellule endoteliali congiuntamente wiAterogenesi come i cambiamenti nell&#39;espressione, localizzazione e modificazioni posttranslazionali delle proteine. Oltre a studiare l&#39;aterogenesi, la forma delle cellule endoteliali osservate nelle preparazioni en faccia viene utilizzata come indicatore del pattern di flusso sanguigno regionale. Tali dati sono importanti per studiare la meccanosignazione delle cellule endoteliali in situ. A questo scopo, non sono utili i vasi sanguigni a sezione trasversale istologica. Pertanto, per la medicina vascolare e la biologia, è particolarmente importante acquisire una tecnica per preparare preparazioni en vena dei vasi sanguigni che consente di osservare un&#39;ampia area della superficie del vascello così come le aree più profonde del sottosuolo. Come rivisto da Jelev e Surchev 1 , i biologi vascolari hanno sviluppato diversi metodi per osservare la fodera dei vasi sanguigni in faccia. Alcuni metodi ingegnosi furono sviluppati negli anni &#39;40 e &#39;50. Usando questi metodi, sono stati<html> In grado di studiare l&#39;organizzazione fondamentale delle cellule endoteliali che fanno riferimento alla superficie interna dei vasi sanguigni. Tuttavia, a causa del modo in cui queste preparazioni sono preparate (il cosiddetto metodo Hautchen 2 , 3 , 4 o il peeling off della superficie del vaso 5 ) e il modo in cui il campione è stato macchiato, non è stato sempre possibile ottenere morfologie ininterrotte Informazioni dalla superficie del vaso nelle zone più profonde della parete del vaso sanguigno. La preparazione completa del vaso di faccia combinata con la colorazione dell&#39;immunofluorescenza ci ha consentito non solo di studiare la morfologia delle cellule endoteliali e l&#39;espressione e la localizzazione delle proteine ​​in queste cellule, ma anche estendere tali studi alla regione subendoteliale della parete del vaso. Studi iniziali che utilizzano vasi sanguigni in faccia preparati macchiati immunoflurezzi cominciarono a apparire negli anni &#39;80 ,F &quot;&gt; 7. Con l&#39;avvento della microscopia confocale a scansione laser e della microscopia multifotonica di recente, è ora possibile ottenere immagini chiare in focus della struttura della parete dei vasi sanguigni in campioni vascolari immunofluorescenti e vascolari in animali vivi 8 , 9 , 10 , 11. Queste tecniche di imaging basate su computer creano immagini a sezione ottica in focus e, impilando tali immagini, è possibile ottenere immagini ricostruite 3D della parete del vascello e della rete vascolare nei tessuti. Può generare immagini di una sezione realizzata lungo l&#39;asse Z dell&#39;immagine ricostruita 12 , 13 . In questo articolo, illustreremo un metodo per la preparazione delle preparazioni in faccia del aorta del topo e dell&#39;arteria carotide per la colorazione immunofluorescenti. I preparativi per il visoPuò essere fatto anche dopo che queste navi sono state manipolate in modo sperimentale. Ad esempio, un&#39;arteria carotide può essere legata parzialmente e quindi una preparazione in faccia eseguita dopo una tale operazione. Per questo motivo, descriveremo anche in questo articolo come facciamo una legatura parziale sull&#39;arteria carotidea. Rispetto alla fabbricazione di preparati simili da animali di grandi dimensioni, come ratti, conigli e umani, i recipienti del mouse sono di taglia piccola e più fragili, richiedendo così una maggiore cura per la manipolazione durante l&#39;isolamento chirurgico dei vasi e preparandoli per la colorazione degli anticorpi e la microscopia. Poiché il modello animale più comunemente utilizzato per la modifica genetica è il topo, diventa critico per molti investigatori di gestire i vasi del mouse senza danneggiarli. In questo manoscritto descriveremo come gestire i vasi sanguigni del mouse quando facciamo preparazioni in faccia dell&#39;arte del topo e dell&#39;arteria carotidea. Ai fini della dimostrazione, utilizzeremo i topi selvatici tipo C57 / b6.

<table><tbody><tr><td>0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500 mL bag</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9788429</td><td></td></tr><tr><td>12-well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>12556005</td><td></td></tr><tr><td>6-0 coated vicryl suture</td><td>Ethicon</td><td>J833G</td><td></td></tr><tr><td>AF488 goat anti-rat IgG&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A11006</td><td></td></tr><tr><td>AF546 goat anti-rabbit IgG&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A11035</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD144 (Ve-Cad)</td><td>BD Biosciences</td><td>BD555289</td><td></td></tr><tr><td>Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG</td><td>Santa Cruze Biotechnology</td><td>Sc-8304</td><td></td></tr><tr><td>Aoto Flow System</td><td>Braintree Scientific</td><td>EZ-AF9000</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave Wrap. 24 inch x 24 inch</td><td>Cardinal Health</td><td>4024</td><td></td></tr><tr><td>Blunt retractors, 2.5 mm wide</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-10</td><td></td></tr><tr><td>Caprofen (Rimadyl)&amp;nbsp;</td><td>zoetis</td><td>NADA#141-199</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhexidine Scrub, 2%</td><td>Med-Vet International</td><td>RXCHLOR2-PC</td><td></td></tr><tr><td>Curity gauze sponges 2 x 2</td><td>Cardinal Health</td><td>KC2146</td><td></td></tr><tr><td>Electric heating pad, 12 x 14</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0667724</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Micro cover glass 22 mm x 50 mm</td><td>VWR</td><td>48393059</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-18</td><td></td></tr><tr><td>normal goat serum</td><td>Equitech-Bio</td><td>GS05</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Solution 4% in PBS</td><td>Santa Cruze Biotechnology</td><td>SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade mountant with DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P-36935</td><td></td></tr><tr><td>Puritan cortton swabs</td><td>VWR</td><td>10806-005</td><td></td></tr><tr><td>Puritan Mini cotton tipped aplicators</td><td>VWR</td><td>82004-050</td><td></td></tr><tr><td>Round handled Needle Holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>12076-12</td><td></td></tr><tr><td>Silk Suture 6/0</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>Spring scissors</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5601</td><td></td></tr><tr><td>Strabismus Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14075-09</td><td></td></tr><tr><td>Super Grip Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>00649-11</td><td></td></tr><tr><td>Transparent Dressing</td><td>Cardinal Health</td><td>TD-26C</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC327371000</td><td></td></tr></tbody></table>

en face preparation of mouse blood vessels

Sezioni di tessuti embedded di paraffina vengono utilizzati abitualmente per lo studio dell&#39;istologia del tessuto e dell&#39;istopatologia. Tuttavia, è difficile determinare ciò che la morfologia tissutale tridimensionale deriva da tali sezioni. Inoltre, le sezioni dei tessuti esaminati non possono contenere la regione all&#39;interno del tessuto necessaria ai fini dello studio in corso. Questa ultima limitazione ostacola gli studi istopatologici dei vasi sanguigni poiché le lesioni vascolari si sviluppano in modo focalizzato. Ciò richiede un metodo che ci permette di rilevare un&#39;ampia area della parete del vaso sanguigno, dalla sua superficie fino alle regioni più profonde. Una preparazione completa dei vasi sanguigni è in grado di soddisfare questo requisito. In questo articolo dimostreremo come fare preparazioni in faccia dell&#39;arte del topo e dell&#39;arteria carotide e di immunofluorescenziarle per la microscopia confocale e altri tipi di immagini a base di fluorescenza.

Un&#39;immagine immunofluorescenza tipica dell&#39;endotelio è mostrata in Figura 3 . Questa immagine mostra una singola sezione ottica di un aorta di topi prese vicino all&#39;apertura di un&#39;arteria intercostale (la grande zona di uovo scuro). L&#39;aorta è stato duplicato con anti-VE-cadherina (verde) e anti-VCAM-1 (molecola adesione cellulare vascolare-1) (rosso). Ogni cellula endoteliale è delineata con una colorazione lineare verde alla giunzione aderente. A ...

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En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

Viene descritta una procedura per preparare preparazioni in faccia della arteria e dell&#39;arto carotide del topo. Tali preparati, quando vengono colorati immunofluorescenti con anticorpi specifici, ci permettono di studiare la localizzazione delle proteine ​​e l&#39;identificazione dei tipi di cellule nell&#39;intera parete vascolare tramite la microscopia confocale.

En Face Preparazione delle navi sanguigne del mouse

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

20.9K Views.  University of Texas MD Anderson Cancer Center.  Viene descritta una procedura per preparare preparazioni in faccia della arteria e dell'arto carotide del topo. Tali preparati, quando vengono colorati immunofluorescenti con anticorpi specifici, ci permettono di studiare la localizzazione delle proteine ​​e l'identificazione dei tipi di cellule nell'intera parete vascolare tramite la microscopia confocale. 

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Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling

The murine spinotrapezius is a thin, superficial skeletal support muscle that extends from T3 to L4, and is easily accessible via dorsal skin incision. Its unique anatomy makes the spinotrapezius useful for investigation of ischemic injury and subsequent microvascular remodeling. Here, we demonstrate an arteriolar ligation model in the murine spinotrapezius muscle that was developed by our research team and previously published1-3. For certain vulnerable mouse strains, such as the Balb/c mouse, this ligation surgery reliably creates skeletal muscle ischemia and serves as a platform for investigating therapies that stimulate revascularization. Methods of assessment are also demonstrated, including the use of intravital and confocal microscopy. The spinotrapezius is well suited to such imaging studies due to its accessibility (superficial dorsal anatomy) and relative thinness (60-200 &mu;m). The spinotrapezius muscle can be mounted en face, facilitating imaging of whole-muscle microvascular networks without histological sectioning. We describe the use of intravital microscopy to acquire metrics following a functional vasodilation procedure; specifically, the increase in arterilar diameter as a result of muscle contraction. We also demonstrate the procedures for harvesting and fixing the tissues, a necessary precursor to immunostaining studies and the use of confocal microscopy.

We demonstrate a novel arterial ligation model in murine spinotrapezius muscle, including a step-by-step procedure and description of required instrumentation. We describe the surgery and relevant outcome measurements relating to vascular network remodeling and functional vasodilation using intravital and confocal microscopy.

Modello murino Spinotrapezius per valutare l&#39;impatto della legatura arteriolare sulla funzione microvascolare e rimodellamento

The murine spinotrapezius is a thin, superficial skeletal support muscle that extends from T3 to L4, and is easily accessible via dorsal skin incision. ...

Ricerca

Medicina

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ability to switch cells from one pathway to another is highly attractive as a therapeutic target. We designed a decoy peptide IRF5D with a molecular modeling software for designing small molecules and peptides.
IRF5D inhibited IRF5, reduced alterations in extracellular matrix, and improved endothelial vasodilation in the tight-skin mouse (Tsk/+). The Kd of IRF5D for recombinant IRF5 is 3.72 &plusmn; 0.74 x 10-6 M as determined by binding experiments using biolayer interferometry experiments. Endothelial cells (EC) proliferation and apoptosis were unchanged using increasing concentrations of IRF5D (0 to 100 &#181;g/mL, 24 h). Tsk/+ mice were treated with IRF5D (1 mg/kg/d subcutaneously, 21 d). IRF5 and ICAM expressions were decreased after IRF5D treatment. Endothelial function was improved as assessed by vasodilation of facialis arteries from Tsk/+ mice treated with IRF5D compared to Tsk/+ mice without IRF5D treatment. As a transcription factor, IRF5 traffics from the cytosol to the nucleus. Translocation was assessed by immunohistochemistry on cardiac myocytes cultured on the different cardiac extracellular matrices. IRF5D treatment of the Tsk/+ mouse resulted in a reduced number of IRF5 positive nuclei in comparison to the animals without IRF5D treatment (50 &#181;g/mL, 24 h). These findings demonstrate the important role that IRF5 plays in inflammation and fibrosis in Tsk/+ mice.

We describe the isolation of cardiac extracellular matrix from C57Bl/6J control mice, tight-skin mice, and tight-skin mice treated with the IRF5 inhibitory peptide. We also describe the vasodilation studies on the isolated vessels from C57Bl/6J, tight-skin mice and tight-skin mice treated with the IRF5 inhibitory peptide.

Vasodilatazione dei vasi isolati e l&#39;isolamento della matrice extracellulare di topi Tight-pelle

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

Immunologia e infezioni

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Purificazione delle navi cervello di topo

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Neuroscienze

<meta charset="utf8"></head><body>Visualizzazione dei periciti retinici mediante pulizia dei tessuti e marcatura fluorescente

3D Visualization of Retinal Vascular Pericytes in Mice by Immunostaining 

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal vasculature. To provide a detailed view of the morphological characteristics of pericytes, this study described a new approach combining the retro-orbital injection of a fluorescent agent, immunofluorescent-staining, and tissue-clearing treatment. Firstly, the fluorescent tomato lectin was injected into the retro-orbital sinus of the live mouse to label the retinal vasculature. After 5 min, the mouse was sacrificed, and its intact retina was carefully removed from the retinal cup and immunofluorescently stained with platelet-derived growth factor receptor &#946; to reveal the pericytes. Additionally, the stained retina was treated with tissue-clearing reagent and whole mounted on the microscope slide. Through these approaches, the retinal vasculature and pericytes were clearly observed in the transparent retina. Under a confocal microscope, we obtained more opportunities to take high-resolution images for further reconstructing and analyzing the morphological characteristics of pericytes along the retinal vascular tree in a three-dimensional view. Methodologically, this protocol offers an effective approach for visualizing pericytes within the retinal vasculature, providing valuable insights into their role under both physiological and pathological conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Visualizzazione 3D dei periciti vascolari retinici nei topi mediante immunocolorazione

The pericytes in retinal vasculature were examined by immunofluorescent staining with platelet-derived growth factor receptor &#946; after retro-orbital injection of fluorescent tomato lectin. The labeled retina was further treated with the tissue-clearing method and whole mounted for visualizing the three-dimensional views of pericytes surrounding retinal vasculature under a confocal microscope.

Visualizzazione 3D dei periciti vascolari retinici nei topi mediante immunocolorazione 

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal ...

Biochimica

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular diseases, such as diabetic retinopathy, hypertensive retinopathy, and possibly glaucoma. Therefore, retinal microvascular preparations are pivotal tools for physiological and pharmacological studies to delineate the underlying pathophysiological mechanisms and to design therapies for the diseases. Despite the wide use of mouse models in ophthalmic research, studies on retinal vascular reactivity are scarce in this species. A major reason for this discrepancy is the challenging isolation procedures owing to the small size of these retinal blood vessels, which is ~ &#8804; 30 &#181;m in luminal diameter. To circumvent the problem of direct isolation of these retinal microvessels for functional studies, we established an isolation and preparation technique that enables ex vivo studies of mouse retinal vasoactivity under near-physiological conditions. Although the present experimental preparations will specifically refer to the mouse retinal arterioles, this methodology can readily be employed to microvessels from rats.

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Many vision-threatening ocular diseases are associated with dysfunctional retinal microvessels. Therefore, the measurement of retinal arteriole responses is important to investigate the underlying pathophysiological mechanisms. This article describes a detailed protocol for mouse retinal arteriole isolation and preparation to assess the effects of vasoactive substances on vascular diameter.

Procedura di preparazione per la misura della reattività in Mouse arteriole retiniche Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard therapy, a considerable number of CLI patients are not suited for either surgical or endovascular revascularization. Angiogenic therapies are emerging as an option for these patients but are currently still under investigation. Before application in humans, those therapies must be tested in animal models and its mechanisms must be clearly understood. An animal model of hindlimb ischemia (HLI) has been developed by the ligation and excision of the distal external iliac and femoral arteries and veins in mice. A comprehensive panel of tests was assembled to assess the effects of ischemia and putative angiogenic therapies at functional, histologic and molecular levels. Laser Doppler was used for the flow measurement and functional assessment of perfusion. Tissue response was evaluated by the analysis of capillary density after staining with the anti-CD31 antibody on histological sections of gastrocnemius muscle and by measurement of collateral vessel density after diaphonization. Expression of angiogenic genes was quantified by RT-PCR targeting selected angiogenic factors exclusively in endothelial cells (ECs) after laser capture microdissection from mice gastrocnemius muscles. These methods were sensitive in identifying differences between ischemic and non-ischemic limbs and between treated and non-treated limbs. This protocol provides a reproducible model of CLI and a framework for testing angiogenic therapies.

Here, a critical hindlimb ischemia experimental model is presented followed by a battery of functional, histologic and molecular tests&#160;to assess the effectiveness of angiogenic therapies.&#8203;

Valutazione dell'angiogenesi terapeutica in un modello Murine di Ischemia hindlimb

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...

Dolicoctasie: demenza vascolare e Alzheimer

A Visual Approach for Inducing Dolichoectasia in Mice to Model Large Vessel-Mediated Cerebrovascular Dysfunction

The blood-brain (BBB) is a crucial system that regulates selective brain circulation with the periphery, as an example, allowing necessary nutrients to enter and expel excessive amino acids or toxins from the brain. To model how the BBB can be compromised in diseases like vascular dementia (VaD) or Alzheimer's disease (AD), researchers developed novel methods to model vessel dilatation. A compromised BBB in these disease states can be detrimental and result in the dysregulation of the BBB leading to untoward and pathological consequences impacting brain function. We were able to modify an existing technique that enabled us to inject directly into the Cisterna magna (CM) to induce dilatation of blood vessels using elastase, and disrupt the tight junctions (TJ) of the BBB. With this method, we were able to see various metrics of success over previous techniques, including consistent blood vessel dilatation, reduced mortality or improved recovery, and improving the fill/opacifying agent, a silicone rubber compound, delivery for labeling blood vessels for dilatation analysis. This modified minimally invasive method has had promising results, with a 19%-32% increase in sustained dilatation of large blood vessels in mice from 2 weeks to 3 months post-injection. This improvement contrasts with previous studies, which showed increased dilatation only at the 2 week mark. Additional data suggests sustained expansion even after 9.5 months. This increase was confirmed by comparing the diameter of blood vessels of the elastase and the vehicle-injected group. Overall, this technique is valuable for studying pathological disorders that affect the central nervous system (CNS) using animal models.

Autore in primo piano: Modellazione dei contributi vascolari alla malattia di Alzheimer nei topi transgenici

We demonstrate chemically inducing large blood vessel dilatation in mice as a model for investigating cerebrovascular dysfunction, which can be used for vascular dementia and Alzheimer's disease modeling. We also demonstrate visualizing the vasculature by injecting silicone rubber compound and providing clear visual guidance for measuring changes in blood vessel size.

Un approccio visivo per indurre la dolicoectasia nei topi per modellare la disfunzione cerebrovascolare mediata da grandi vasi

The blood-brain (BBB) is a crucial system that regulates selective brain circulation with the periphery, as an example, allowing necessary nutrients to ...

En Face Preparazione delle navi sanguigne del mouse

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Modello murino Spinotrapezius per valutare l'impatto della legatura arteriolare sulla funzione microvascolare e rimodellamento

Vasodilatazione dei vasi isolati e l'isolamento della matrice extracellulare di topi Tight-pelle

Purificazione delle navi cervello di topo

Visualizzazione 3D dei periciti vascolari retinici nei topi mediante immunocolorazione

Visualizzazione 3D dei periciti vascolari retinici nei topi mediante immunocolorazione

Visualizzazione 3D dei periciti vascolari retinici nei topi mediante immunocolorazione

Procedura di preparazione per la misura della reattività in Mouse arteriole retiniche Ex Vivo

Valutazione dell'angiogenesi terapeutica in un modello Murine di Ischemia hindlimb

Un approccio visivo per indurre la dolicoectasia nei topi per modellare la disfunzione cerebrovascolare mediata da grandi vasi

Un approccio visivo per indurre la dolicoectasia nei topi per modellare la disfunzione cerebrovascolare mediata da grandi vasi