As atividades de pesquisa dos autores são suportadas por concessões do instituto nacional da saúde ao Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551).

Os protocolos para a ligadura da artéria carótida parcial do mouse e o isolamento da aorta do rato e da artéria carótida para a imunocoloração de face são aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IBT 2014-9231). 1. Ligação da Artéria Carótida Parcial Esquerda <ol><li> Prepare o espaço cirúrgico, colocando uma almofada de aquecimento de 12 polegadas x 14 polegadas sobre a mesa e cobrir a almofada e tampo da mesa com um grande drapeado cirúrgico limpo. Ajuste o braço do suporte da barra para que o campo de visão do estereomicroscópio esteja na área central da almofada de aquecimento. </li><li> Ligue a almofada de aquecimento na mesa e coloque o botão de controlo de 3 posições no nível de calor médio. Neste ajuste de temperatura, a superfície da placa cirúrgica (ver 1.6.1) será de 38-40 ° C. <ol><li> Coloque uma gaiola limpa em outra almofada de aquecimento. Gire a almofada de aquecimento como acima. Esta gaiola será utilizada para a recuperação após a cirurgia (ver 1.16), bem como para a habitação. </li></ol></lI&gt; <li> Na mesa cirúrgica, coloque uma bolsa de esterilização autoclavada contendo tesoura de íris (1 par), pinça de tecido (1 par), pinça de aperto super (2 pares), tesoura de mola (1 par), retractor sem corte (1 par, (1), sutura de seda 6-0 esterilizada, aplicadores com ponta de algodão, mini aplicadores com ponta de algodão, cortinas cirúrgicas e esponjas de gaze de 2 &quot;x 2&quot;. Coloque também um frasco de compressão contendo 70% de etanol e outro contendo clorhexidina cirúrgica na mesa cirúrgica. </li><li> Pesar um mouse. O peso corporal é necessário para determinar a quantidade adequada de analgesia, que será administrada imediatamente antes da cirurgia. </li><li> Coloque um mouse na câmara de indução. </li><li> Ligue o tanque de oxigênio eo vaporizador anestésico para anestesiar o mouse na câmara de indução. Manter o nível de isoflurano a 2%. Demora 3-5 minutos antes que o mouse parar de se mover. <ol><li> Enquanto o mouse está sendo anestheColoque um pedaço menor de tecido cirúrgico estéril (24 polegadas x 24 polegadas) sob o microscópio estereoscópico para criar uma superfície cirúrgica. Em seguida, coloque uma placa cirúrgica acrílica (que foi limpo com álcool 70%) na superfície drapejada. A placa cirúrgica deve, portanto, estar na almofada de aquecimento, mas separada por duas camadas de cortinas cirúrgicas. </li></ol></li><li> Quando o mouse pára de se mover na câmara de indução, transfira o mouse para uma área de preparação pré-cirúrgica e posicione seu nariz no cone nariz conectado ao vaporizador (isoflurano a 2%). Remova o cabelo em torno da área cervical usando um aparador elétrico ou loção removedor de cabelo. Recomendamos loção remoção de pêlos, porque este método não vai produzir pedaços de cabelo solto, que são difíceis de remover completamente da área cirúrgica. </li><li> Com o nariz-cone no lugar, mova o mouse para a placa cirúrgica. <ol><li> Tape para baixo as patas dianteiras direita e esquerda para a placa cirúrgica. Tape para baixo ambas as pernas traseiras togeNo lado direito do mouse. Isto provoca uma ligeira rotação do corpo do rato de tal modo que o lado esquerdo da área do pescoço do rato fica melhor posicionado para a cirurgia. </li></ol></li><li> Desinfectar a área da incisão com 70% de álcool, clorexidina esfrega cirúrgica, e novamente com 70% de álcool. Cubra o mouse com um pano cirúrgico esterilizado, exceto para a área da incisão cervical. </li><li> Confirme com uma pitada de dedo que o ratinho está completamente anestesiado e administre analgesia (Caprofen 3-5 mg / kg) via injecção intraperitoneal ou subcutânea. </li><li> Sob o microscópio dissecante, faça uma incisão ventral da linha média ao redor da área cervical usando um scalpel ou tesoura de íris. NOTA: Usamos tesoura porque a distância de trabalho do estereomicroscópio é limitada, o que torna difícil usar um bisturi. </li><li> Expor a artéria carótida comum esquerda (LCCA), empurrando para o lado e reposicionando as glândulas salivares que cobrem os vasos sanguíneos para o lado esquerdo da aNimal. </li><li> Identificar todos os vasos sanguíneos no campo cirúrgico ( Figura 1 ). A LCCA bifurca na artéria carótida interna esquerda (ICA) e na artéria carótida externa esquerda (ECA). A artéria tireoidiana superficial (STA) surge da ECA no lado medial. A artéria occipital (OA) costuma surgir da ECA, mas em alguns ratos ela surge da ICA. </li><li> Ligatar todos os ramos da artéria, exceto o OA usando sutura de seda esterilizada 6-0. Para conseguir isto, faça as duas ligações seguintes. <ol><li> Remova cuidadosamente o tecido conjuntivo ao redor e abaixo da artéria carótida interna esquerda (ICA). Pegue um pedaço de sutura de sutura pré-cortada 6-0 (~ 2,5 cm) com fórceps e passe-o sob a artéria. Usando outro par de pinças, puxe a sutura cerca de 1/3 do seu comprimento e ligue a artéria. </li><li> Remova o tecido conjuntivo em torno da artéria carótida externa esquerda (ECA) da mesma maneira descrita acima e faça uma ligadura proximal ao tiróide superior esquerdoD (STA) ( Figura 1 ). Tenha cuidado para não danificar as fibras nervosas que correm dentro do campo cirúrgico. </li></ol></li><li> Quando estas ligaduras foram feitas, retornar as glândulas salivares para a posição original e hidratar o campo cirúrgico, colocando 2-3 gotas de solução salina estéril. Feche a pele usando suturas Vicryl revestidas com 6-0. </li><li> Após a cirurgia, coloque o mouse na gaiola pré-aquecida (ver 1.2.1). O rato deve acordar dentro de 5 min e começar a andar ao redor. Uma vez confirmado que o mouse se comporta normalmente, leve a gaiola para a sala de alojamento dos animais. </li><li> Observe o mouse diariamente durante os primeiros 3 dias de recuperação. O rato pode ser mantido, desde que a experiência exija sob as várias condições que o protocolo experimental requer. As preparações faciais podem ser feitas a qualquer momento após a cirurgia. </li></ol> 2. En Face Immunostaining <ol><li> Eutanizar um rato com CO 2 por overdose por inalação. </li><li>Tape o mouse em uma posição supina (lado do ventre para cima) em uma placa de dissecação. </li><li> Exponha a cavidade abdominal fazendo uma incisão na linha média usando uma tesoura de íris. </li><li> Expor a cavidade torácica cortando as costelas lateralmente ao esterno. </li><li> Fazer um entalhe na veia cava ou cortar uma das artérias femorais para drenar o sangue. </li><li> Inserir uma agulha de 26 G ligada a uma instalação de perfusão por gravidade (120 cm de pressão de água) no ápice do ventrículo esquerdo e perfundir o sistema circulatório com solução salina contendo heparina (40 U / mL). Continue a perfusão até que a solução salina que flui para fora do corte torna-se clara. </li><li> Mudar o sistema de perfusão de soro fisiológico para a solução de fixação contendo paraformaldeído a 4% em PBS (solução salina tamponada com fosfato) e continuar a perfusão durante mais 5 min. </li><li> Colher a aorta e ambas as artérias carótidas esquerda e direita usando tesoura de ponta romba e fórceps, e colocar em um tubo cônico de 50 mL contendo o fixador em gelo. </li><li&gt; Transfira o recipiente para uma placa de Petri contendo PBS sob um microscópio de dissecação e remova cuidadosamente a gordura e os tecidos conjuntivos ligados à aorta e às artérias carótidas. Separar e dividir a aorta e as artérias carótidas longitudinalmente para expor o endotélio ( Figura 2 ). </li><li> Transferir cada recipiente separadamente para um poço de uma placa de 12 poços contendo 0,5 mL de uma solução permeabilizante (Triton X-100 a 0,1% em PBS) por poço. Permeabilize vasos sanguíneos durante 10 min com oscilação à temperatura ambiente (RT). </li><li> Lavar brevemente com PBS. </li><li> Para bloquear locais de ligação de anticorpos não específicos, incubar os vasos sanguíneos em soro normal a 10% da espécie animal na qual os anticorpos secundários foram feitos, em TTBS (solução salina tamponada com Tris (TBS) com Tween 20 a 2,5%) durante 30 min com Balançando na RT. </li><li> Incubar os vasos com os anticorpos primários adequadamente diluídos em TTBS com 10% de soro normal (como descrito acima) durante a noite com oscilação a 4 ° C. O nívelDe diluição deve ser determinada para cada anticorpo. </li><li> Execute a seguinte coloração de controlo. <ol><li> Incubar vasos com TTBS em vez de um anticorpo primário seguido por incubação com um anticorpo secundário. </li><li> Incubar vasos com TTBS contendo soro não imune (ou pré-imune) ou Ig do mesmo animal (espécie) em que foram feitos anticorpos primários, seguido de incubação com um anticorpo secundário. </li><li> Omitir a incubação com um anticorpo secundário. Estas amostras de controlo devem ser manuseadas da mesma maneira e ao mesmo tempo em que é realizada a coloração com anticorpos específicos. </li></ol></li><li> Lavar os vasos sanguíneos 3 vezes com TTBS durante 10 min cada com oscilação à RT. </li><li> Incubar com anticorpos secundários marcados fluorescentemente diluídos apropriadamente em TTBS com 10% de soro normal (como descrito acima) durante 1 h com oscilação à RT. A coloração nuclear com DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole) pode ser realizada simultaneamente aT nesta fase adicionando 1/5000 em volume de uma solução stock DAPI que contém 5 mg / mL de DAPI em H2O. </li><li> Lavar 3 vezes com TTBS durante 10 min cada com oscilação à RT. </li><li> Enxaguar brevemente em PBS. </li><li> Coloque uma gota do reagente anti-fade em uma tampa de vidro (22 mm x 50 mm) e coloque um vaso sanguíneo sobre a tampa de vidro com o endotélio virado para baixo. </li><li> Coloque um vidro de slide (22 mm x 75 mm) no vaso sanguíneo, evitando bolhas de captura. </li><li> Coloque a lâmina em um limpador de laboratório limpo ( por exemplo, Kimwipe) e cubra a lâmina com dois pedaços de esfregão de laboratório. Coloque suavemente 3.5 kg de peso ( por exemplo, use uma garrafa de água em um livro grosso.) No slide por um máximo de 5 min para aplainar a amostra de vasos sangüíneos en face. </li><li> Remova o peso e limpe o excesso de solução em torno da lamela. </li><li> Aplique esmalte nas 4 esquinas da lamela, coloque as lâminas em uma caixa de slide, lado da lamela para cima e mantenha no escuro em RT(Ou 4 ° C) durante a noite. Este processo aplana o tecido ainda mais e torna mais fácil fazer a microscopia em altas ampliações. </li><li> Seal o coverslip completamente usando unha polonês. </li><li> Realize a microscopia assim que o esmalte estiver seco. </li><li> Se necessário, armazene as lâminas a -20 ° C. </li></ol>

<ol>
	<li>Jelev, L., Surchev, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+simple+technique+for+en+face+endothelial+observations+using+water-soluble+media+-'thinned-wall'+preparations.">A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -'thinned-wall' preparations.</a> J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).</li><li>Neill, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+on+venous+endothelium+of+alterations+in+blood+flow+through+the+vessels+in+vein+walls,+and+the+possible+relation+to+thrombosis.">The effect on venous endothelium of alterations in blood flow through the vessels in vein walls, and the possible relation to thrombosis.</a> Ann Surg. 126 (3), 270-288 (1947).</li><li>Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+examining+the+endothelial+cytoskeleton+in+situ+using+immunofluorescence.">A method for examining the endothelial cytoskeleton in situ using immunofluorescence.</a> J Histochem Cytochem. 11 (11), 1317-1320 (1983).</li><li>Poole, J. C. F., Sanders, A. G., Florey, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regeneration+of+aortic+endothelium.">The regeneration of aortic endothelium.</a> J Pathol Bacteriol. 75, 133-143 (1958).</li><li>Sade, R. M., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=En+face+stripping+of+vascular+endothelium.">En face stripping of vascular endothelium.</a> Microvasc Res. 4, 77-80 (1972).</li><li>White, G. E., Gimbrone, M. A., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+expression+of+stress+fibers+in+vascular+endothelial+cells+in+situ.">Factors influencing the expression of stress fibers in vascular endothelial cells in situ.</a> J Cell Biol. 97 (2), 416-424 (1983).</li><li>Kim, D. W., Gotlieb, A. I., Langille, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+modulation+of+endothelial+F-actin+microfilaments+by+experimental+alterations+in+shear+stress.">In vivo modulation of endothelial F-actin microfilaments by experimental alterations in shear stress.</a> Arteriosclero. 9, 439-445 (1989).</li><li>Haka, A., Potteaux, S., Fraser, H., Randolph, G., Maxfield, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+monocyte+subpopulations+in+murine+atherosclerotic+plaques+by+multiphoton+microscopy.">Quantitative analysis of monocyte subpopulations in murine atherosclerotic plaques by multiphoton microscopy.</a> Plos ONE. 7 (9), 244823e (2012).</li><li>Ch&#232;vre, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+imaging+of+intravascular+atherogenic+inflammation+in+live+mice.">High-Resolution imaging of intravascular atherogenic inflammation in live mice.</a> Circ Res. 114, 770-779 (2014).</li><li>Heo, K. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbed+flow-activated+p90RSK+kinase+accelerates+atherosclerosis+by+inhibiting+SENP2+function.">Disturbed flow-activated p90RSK kinase accelerates atherosclerosis by inhibiting SENP2 function.</a> J Clin Invest. 125 (3), 1299-1310 (2015).</li><li>Le, N. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crucial+role+for+p90RSK-mediated+reduction+of+ERK5+transcriptional+activity+in+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis.">A crucial role for p90RSK-mediated reduction of ERK5 transcriptional activity in endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> Circ. 127, 486-499 (2013).</li><li>Kano, Y., Katoh, K., Masuda, M., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+composition+of+stress+fiber-plasma+membrane+attachment+sites+in+endothelial+cells+in+situ.">Macromolecular composition of stress fiber-plasma membrane attachment sites in endothelial cells in situ.</a> Circ Res. 79, 1000-1006 (1996).</li><li>Nigro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophilin+A+is+an+inflammatory+mediator+that+promotes+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-dependent+mice.">Cyclophilin A is an inflammatory mediator that promotes atherosclerosis in apolipoprotein E-dependent mice.</a> J Exp Med. 208 (1), 53-66 (2011).</li><li>Mattson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+arterial+blood+pressure+in+different+strains+of+mice.">Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice.</a> Am J Hypertens. 14 (5), 405-408 (2001).</li><li>Jinguji, Y., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+fiber+dependent+axial+organization+of+fibronectin+fibrils+in+the+basal+lamina+of+the+chick+and+mesenteric+artery.">Stress fiber dependent axial organization of fibronectin fibrils in the basal lamina of the chick and mesenteric artery.</a> Endothelium. 2, 35-47 (1994).</li><li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Lust, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+tissue+clearing+(PACT):+Technical+evaluations+and+new+perspectives+in+immunofluorescence,+histology,+and+ultrastructure.">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluations and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Sci Rep. 6, 34331 (2016).</li></ol>

Ao manusear os vasos sanguíneos do rato, é importante lembrar que o endotélio é frágil e que qualquer força mecânica excessiva danificará as células endoteliais. Por exemplo, as células endoteliais quebram ou se desprendem da parede do vaso se o vaso é perfundido com muita força, o que pode acontecer facilmente quando a vasculatura é perfundida usando uma seringa operada manualmente. Para obter uma pressão de perfusão constante, utilizamos um sistema de perfusão por gravidade...

Para estudos histopatológicos por microscopia óptica, tridimensional partes de tecidos biológicos são rotineiramente processados ​​para parafina embedment seguido de seccionamento e coloração. Uma amostra de tecido que foi embebida em parafina pode ter vários milímetros em todas as três dimensões. No entanto, para a finalidade da microscopia de luz, deve ser primeiro seccionado de modo que a luz possa atravessar e manchada então de modo que a seção fina rendesse o suficiente contraste para a imagem latente. Porque os espécimes seccionados são geralmente 5-10 μm na espessura, um vê somente uma fração muito pequena do espécime inteiro em duas dimensões de cada vez. É possível coletar seções seqüenciais e, após a imagem de cada seção individualmente, realizar reconstrução assistida por computador das imagens 3D, mas este é um trabalho tedioso. Histopatologia dos vasos sanguíneos, especialmente para o estudo da patogênese da aterosclerose, apresenta problemas únicos. A aterosclerose é uma doença focalizada que desenvolveLocalmente em áreas onde ocorre o fluxo sanguíneo perturbado. Além disso, a doença é iniciada dentro da íntima, um tecido fino constituído por uma monocamada de células endoteliais e matriz extracelular, de grandes artérias. Por estas razões, é um desafio para localizar e estudar lesões precoces usando vasos sanguíneos seccionados, porque pode-se facilmente deixar de seccionar a lesão. Mesmo se uma secção incluir uma área doente, ver-se-á apenas uma porção de 5-10 μm contendo células endoteliais e outras células da parede vascular nos meios e adventitia. Preparações completas de montagem em face (pronunciadas än fäs) nos permitem examinar uma vasta área da superfície do vaso sanguíneo, como a aorta inteira da raiz da aorta, até as artérias ilíacas comuns. Utilizando um tal espécime corado com anticorpos específicos e outras sondas específicas, pode-se identificar a localização das lesões e também onde ocorrem vários eventos moleculares em células endoteliais em conjunção comA aterogénese, tais como alterações na expressão, localização e modificações pós-traducionais de proteínas. Além de estudar a aterogênese, a forma de célula endotelial observada em preparações faciais é usada como um indicador do padrão regional de fluxo sanguíneo em tempo médio. Tais dados são importantes para o estudo da cicatrização mecânica de células endoteliais in situ. Para esta finalidade, os vasos sanguíneos histológicos transversais de corte não são úteis. Assim, para medicina vascular e biologia, é especialmente importante adquirir uma técnica para fazer preparações en face de vasos sanguíneos que permite observar uma vasta área da superfície do vaso, bem como as áreas mais profundas subsuperfície do vaso. Conforme revisto por Jelev e Surchev 1 , os biólogos vasculares desenvolveram vários métodos para observar o revestimento dos vasos sanguíneos em face. Alguns métodos engenhosos foram desenvolvidos nos anos 1940 e 1950. Usando esses métodos, eles foram<html> Capaz de estudar a organização fundamental das células endoteliais que revestem a superfície interna dos vasos sanguíneos. No entanto, devido ao modo como estas preparações em face são preparadas (o chamado método de Hautchen 2 , 3 , 4 ou descascamento da superfície do recipiente 5 ) e a forma como o espécime foi corado, nem sempre foi possível obter uma morfologia morfológica ininterrupta Informações da superfície do vaso para as áreas mais profundas da parede dos vasos sanguíneos. A preparação de vasos en-face de montagem completa combinada com a coloração por imunofluorescência permitiu não apenas estudar a morfologia das células endoteliais ea expressão e localização das proteínas nessas células, mas também estender esses estudos à região subendotelial da parede do vaso. Os primeiros estudos usando vasos sanguíneos en face preparações imunoflurescently manchadas começaram a aparecer na década de 1980 6 ,7. Com o advento da microscopia confocal de varrimento a laser e, mais recentemente, a microscopia multifotónica, pode-se agora obter imagens nítidas claras da estrutura da parede dos vasos sanguíneos em amostras de vasos en face imunofluorescentemente corados bem como a rede vascular em animais vivos 8 , 9 , 10 , 11. Estas técnicas de imagem baseadas em computador criam imagens seccionadas ópticas em foco e, empilhando-as, podem obter-se imagens 3D reconstruídas da parede vascular e da rede vascular nos tecidos. Pode gerar imagens de uma secção feita ao longo do eixo Z da imagem reconstruída 12 , 13 . Neste artigo, iremos ilustrar um método para preparar preparações en face da aorta do rato e da artéria carótida para a coloração imunof luorescente. En face preparaçõesPode ser feita mesmo depois destes vasos terem sido experimentalmente manipulados. Por exemplo, uma artéria carótida pode ser ligada parcialmente e depois uma preparação en face preparada após tal cirurgia. Por esta razão, também descreveremos neste artigo como realizamos uma ligadura parcial na artéria carótida. Comparados com preparações semelhantes de animais maiores tais como ratos, coelhos e seres humanos, os vasos de ratinho são de pequeno tamanho e mais frágeis, necessitando assim de cuidados adicionais durante o isolamento cirúrgico dos vasos e preparando-os para a coloração de anticorpos e a microscopia. Como o modelo animal mais comumente usado para a modificação genética é o mouse, torna-se crítico para muitos pesquisadores lidar com vasos de mouse sem danificá-los. Neste manuscrito, vamos descrever como lidar com os vasos sanguíneos do rato quando se fazem preparações en face da aorta do rato e da artéria carótida. Para efeitos de demonstração, utilizaremos ratinhos C57 / b6 de tipo selvagem.

<table><tbody><tr><td>0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500 mL bag</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9788429</td><td></td></tr><tr><td>12-well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>12556005</td><td></td></tr><tr><td>6-0 coated vicryl suture</td><td>Ethicon</td><td>J833G</td><td></td></tr><tr><td>AF488 goat anti-rat IgG&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A11006</td><td></td></tr><tr><td>AF546 goat anti-rabbit IgG&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A11035</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD144 (Ve-Cad)</td><td>BD Biosciences</td><td>BD555289</td><td></td></tr><tr><td>Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG</td><td>Santa Cruze Biotechnology</td><td>Sc-8304</td><td></td></tr><tr><td>Aoto Flow System</td><td>Braintree Scientific</td><td>EZ-AF9000</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave Wrap. 24 inch x 24 inch</td><td>Cardinal Health</td><td>4024</td><td></td></tr><tr><td>Blunt retractors, 2.5 mm wide</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-10</td><td></td></tr><tr><td>Caprofen (Rimadyl)&amp;nbsp;</td><td>zoetis</td><td>NADA#141-199</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhexidine Scrub, 2%</td><td>Med-Vet International</td><td>RXCHLOR2-PC</td><td></td></tr><tr><td>Curity gauze sponges 2 x 2</td><td>Cardinal Health</td><td>KC2146</td><td></td></tr><tr><td>Electric heating pad, 12 x 14</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0667724</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Micro cover glass 22 mm x 50 mm</td><td>VWR</td><td>48393059</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-18</td><td></td></tr><tr><td>normal goat serum</td><td>Equitech-Bio</td><td>GS05</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Solution 4% in PBS</td><td>Santa Cruze Biotechnology</td><td>SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade mountant with DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P-36935</td><td></td></tr><tr><td>Puritan cortton swabs</td><td>VWR</td><td>10806-005</td><td></td></tr><tr><td>Puritan Mini cotton tipped aplicators</td><td>VWR</td><td>82004-050</td><td></td></tr><tr><td>Round handled Needle Holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>12076-12</td><td></td></tr><tr><td>Silk Suture 6/0</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>Spring scissors</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5601</td><td></td></tr><tr><td>Strabismus Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14075-09</td><td></td></tr><tr><td>Super Grip Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>00649-11</td><td></td></tr><tr><td>Transparent Dressing</td><td>Cardinal Health</td><td>TD-26C</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC327371000</td><td></td></tr></tbody></table>

en face preparation of mouse blood vessels

As secções de tecidos embebidos em parafina são rotineiramente utilizadas para estudar histologia de tecido e histopatologia. No entanto, é difícil determinar qual é a morfologia tridimensional do tecido a partir dessas seções. Além disso, as secções dos tecidos examinados podem não conter a região dentro do tecido que é necessária para a finalidade do estudo em curso. Esta última limitação dificulta estudos histopatológicos de vasos sanguíneos uma vez que as lesões vasculares se desenvolvem de forma focalizada. Isto requer um método que nos permita examinar uma vasta área da parede dos vasos sanguíneos, desde a sua superfície até regiões mais profundas. Uma montagem completa en face preparação dos vasos sanguíneos cumpre este requisito. Neste artigo, vamos demonstrar como fazer preparações en face da aorta do rato e da artéria carótida e imunofluorescentemente mancha-los para microscopia confocal e outros tipos de imagem baseada em fluorescência.

Uma imagem de imunofluorescência em face típica do endotélio é mostrada na Figura 3 . Esta imagem mostra uma única secção óptica de uma aorta do rato tomada perto da abertura de uma artéria intercostal (a grande área escura em forma de ovo). A aorta foi duplamente corada com anti-VE-caderina (verde) e anti-VCAM-1 (molécula de adesão celular vascular-1) (vermelho). Cada célula endotelial é delineada com uma coloração linear verde na junção dos aderentes....

Watch this Scientific Journal Video about En Face Preparation of Mouse Blood Vessels at JoVE.com

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

É descrito um procedimento para preparar preparações en face da artéria carótida e da aorta do rato. Tais preparações, quando imunofluorescentemente coradas com anticorpos específicos, permitem estudar a localização de proteínas e a identificação de tipos de células dentro de toda a parede vascular por microscopia confocal.

En Face Preparação de Vasos Sanguíneos de Rato

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...

en-face-preparation-of-mouse-blood-vessels

Research

JoVE Journal

Biology

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

20.9K visualizações.  University of Texas MD Anderson Cancer Center.  É descrito um procedimento para preparar preparações en face da artéria carótida e da aorta do rato. Tais preparações, quando imunofluorescentemente coradas com anticorpos específicos, permitem estudar a localização de proteínas e a identificação de tipos de células dentro de toda a parede vascular por microscopia confocal. 

Vídeo: En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling

The murine spinotrapezius is a thin, superficial skeletal support muscle that extends from T3 to L4, and is easily accessible via dorsal skin incision. Its unique anatomy makes the spinotrapezius useful for investigation of ischemic injury and subsequent microvascular remodeling. Here, we demonstrate an arteriolar ligation model in the murine spinotrapezius muscle that was developed by our research team and previously published1-3. For certain vulnerable mouse strains, such as the Balb/c mouse, this ligation surgery reliably creates skeletal muscle ischemia and serves as a platform for investigating therapies that stimulate revascularization. Methods of assessment are also demonstrated, including the use of intravital and confocal microscopy. The spinotrapezius is well suited to such imaging studies due to its accessibility (superficial dorsal anatomy) and relative thinness (60-200 &mu;m). The spinotrapezius muscle can be mounted en face, facilitating imaging of whole-muscle microvascular networks without histological sectioning. We describe the use of intravital microscopy to acquire metrics following a functional vasodilation procedure; specifically, the increase in arterilar diameter as a result of muscle contraction. We also demonstrate the procedures for harvesting and fixing the tissues, a necessary precursor to immunostaining studies and the use of confocal microscopy.

We demonstrate a novel arterial ligation model in murine spinotrapezius muscle, including a step-by-step procedure and description of required instrumentation. We describe the surgery and relevant outcome measurements relating to vascular network remodeling and functional vasodilation using intravital and confocal microscopy.

Modelo Spinotrapezius murino para avaliar o impacto da ligadura arteriolar em função microvascular e Remodelação

The murine spinotrapezius is a thin, superficial skeletal support muscle that extends from T3 to L4, and is easily accessible via dorsal skin incision. ...

Medicina

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ability to switch cells from one pathway to another is highly attractive as a therapeutic target. We designed a decoy peptide IRF5D with a molecular modeling software for designing small molecules and peptides.
IRF5D inhibited IRF5, reduced alterations in extracellular matrix, and improved endothelial vasodilation in the tight-skin mouse (Tsk/+). The Kd of IRF5D for recombinant IRF5 is 3.72 &plusmn; 0.74 x 10-6 M as determined by binding experiments using biolayer interferometry experiments. Endothelial cells (EC) proliferation and apoptosis were unchanged using increasing concentrations of IRF5D (0 to 100 &#181;g/mL, 24 h). Tsk/+ mice were treated with IRF5D (1 mg/kg/d subcutaneously, 21 d). IRF5 and ICAM expressions were decreased after IRF5D treatment. Endothelial function was improved as assessed by vasodilation of facialis arteries from Tsk/+ mice treated with IRF5D compared to Tsk/+ mice without IRF5D treatment. As a transcription factor, IRF5 traffics from the cytosol to the nucleus. Translocation was assessed by immunohistochemistry on cardiac myocytes cultured on the different cardiac extracellular matrices. IRF5D treatment of the Tsk/+ mouse resulted in a reduced number of IRF5 positive nuclei in comparison to the animals without IRF5D treatment (50 &#181;g/mL, 24 h). These findings demonstrate the important role that IRF5 plays in inflammation and fibrosis in Tsk/+ mice.

We describe the isolation of cardiac extracellular matrix from C57Bl/6J control mice, tight-skin mice, and tight-skin mice treated with the IRF5 inhibitory peptide. We also describe the vasodilation studies on the isolated vessels from C57Bl/6J, tight-skin mice and tight-skin mice treated with the IRF5 inhibitory peptide.

Vasodilatação de isolado navios e o isolamento da matriz extracelular do Mice Tight-pele

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

Imunologia e Infecção

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Purificação de embarcações do cérebro do rato

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Neurociência

<meta charset="utf8"></head><body>Visualização de pericitos retinianos usando limpeza de tecidos e marcação fluorescente

3D Visualization of Retinal Vascular Pericytes in Mice by Immunostaining 

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal vasculature. To provide a detailed view of the morphological characteristics of pericytes, this study described a new approach combining the retro-orbital injection of a fluorescent agent, immunofluorescent-staining, and tissue-clearing treatment. Firstly, the fluorescent tomato lectin was injected into the retro-orbital sinus of the live mouse to label the retinal vasculature. After 5 min, the mouse was sacrificed, and its intact retina was carefully removed from the retinal cup and immunofluorescently stained with platelet-derived growth factor receptor &#946; to reveal the pericytes. Additionally, the stained retina was treated with tissue-clearing reagent and whole mounted on the microscope slide. Through these approaches, the retinal vasculature and pericytes were clearly observed in the transparent retina. Under a confocal microscope, we obtained more opportunities to take high-resolution images for further reconstructing and analyzing the morphological characteristics of pericytes along the retinal vascular tree in a three-dimensional view. Methodologically, this protocol offers an effective approach for visualizing pericytes within the retinal vasculature, providing valuable insights into their role under both physiological and pathological conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Visualização 3D de pericitos vasculares da retina em camundongos por imunocoloração

The pericytes in retinal vasculature were examined by immunofluorescent staining with platelet-derived growth factor receptor &#946; after retro-orbital injection of fluorescent tomato lectin. The labeled retina was further treated with the tissue-clearing method and whole mounted for visualizing the three-dimensional views of pericytes surrounding retinal vasculature under a confocal microscope.

Visualização 3D de pericitos vasculares da retina em camundongos por imunocoloração 

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal ...

Bioquímica

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular diseases, such as diabetic retinopathy, hypertensive retinopathy, and possibly glaucoma. Therefore, retinal microvascular preparations are pivotal tools for physiological and pharmacological studies to delineate the underlying pathophysiological mechanisms and to design therapies for the diseases. Despite the wide use of mouse models in ophthalmic research, studies on retinal vascular reactivity are scarce in this species. A major reason for this discrepancy is the challenging isolation procedures owing to the small size of these retinal blood vessels, which is ~ &#8804; 30 &#181;m in luminal diameter. To circumvent the problem of direct isolation of these retinal microvessels for functional studies, we established an isolation and preparation technique that enables ex vivo studies of mouse retinal vasoactivity under near-physiological conditions. Although the present experimental preparations will specifically refer to the mouse retinal arterioles, this methodology can readily be employed to microvessels from rats.

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Many vision-threatening ocular diseases are associated with dysfunctional retinal microvessels. Therefore, the measurement of retinal arteriole responses is important to investigate the underlying pathophysiological mechanisms. This article describes a detailed protocol for mouse retinal arteriole isolation and preparation to assess the effects of vasoactive substances on vascular diameter.

Etapas de preparação para medição de reatividade no Mouse arteríolas retina Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard therapy, a considerable number of CLI patients are not suited for either surgical or endovascular revascularization. Angiogenic therapies are emerging as an option for these patients but are currently still under investigation. Before application in humans, those therapies must be tested in animal models and its mechanisms must be clearly understood. An animal model of hindlimb ischemia (HLI) has been developed by the ligation and excision of the distal external iliac and femoral arteries and veins in mice. A comprehensive panel of tests was assembled to assess the effects of ischemia and putative angiogenic therapies at functional, histologic and molecular levels. Laser Doppler was used for the flow measurement and functional assessment of perfusion. Tissue response was evaluated by the analysis of capillary density after staining with the anti-CD31 antibody on histological sections of gastrocnemius muscle and by measurement of collateral vessel density after diaphonization. Expression of angiogenic genes was quantified by RT-PCR targeting selected angiogenic factors exclusively in endothelial cells (ECs) after laser capture microdissection from mice gastrocnemius muscles. These methods were sensitive in identifying differences between ischemic and non-ischemic limbs and between treated and non-treated limbs. This protocol provides a reproducible model of CLI and a framework for testing angiogenic therapies.

Here, a critical hindlimb ischemia experimental model is presented followed by a battery of functional, histologic and molecular tests&#160;to assess the effectiveness of angiogenic therapies.&#8203;

Avaliando a angiogênese terapêutica em um modelo murino de isquemia Retromembro

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...

Dolicoectasia: Demência Vascular e Alzheimer

A Visual Approach for Inducing Dolichoectasia in Mice to Model Large Vessel-Mediated Cerebrovascular Dysfunction

The blood-brain (BBB) is a crucial system that regulates selective brain circulation with the periphery, as an example, allowing necessary nutrients to enter and expel excessive amino acids or toxins from the brain. To model how the BBB can be compromised in diseases like vascular dementia (VaD) or Alzheimer's disease (AD), researchers developed novel methods to model vessel dilatation. A compromised BBB in these disease states can be detrimental and result in the dysregulation of the BBB leading to untoward and pathological consequences impacting brain function. We were able to modify an existing technique that enabled us to inject directly into the Cisterna magna (CM) to induce dilatation of blood vessels using elastase, and disrupt the tight junctions (TJ) of the BBB. With this method, we were able to see various metrics of success over previous techniques, including consistent blood vessel dilatation, reduced mortality or improved recovery, and improving the fill/opacifying agent, a silicone rubber compound, delivery for labeling blood vessels for dilatation analysis. This modified minimally invasive method has had promising results, with a 19%-32% increase in sustained dilatation of large blood vessels in mice from 2 weeks to 3 months post-injection. This improvement contrasts with previous studies, which showed increased dilatation only at the 2 week mark. Additional data suggests sustained expansion even after 9.5 months. This increase was confirmed by comparing the diameter of blood vessels of the elastase and the vehicle-injected group. Overall, this technique is valuable for studying pathological disorders that affect the central nervous system (CNS) using animal models.

Autor em destaque: Modelagem de contribuições vasculares para a doença de Alzheimer em camundongos transgênicos

We demonstrate chemically inducing large blood vessel dilatation in mice as a model for investigating cerebrovascular dysfunction, which can be used for vascular dementia and Alzheimer's disease modeling. We also demonstrate visualizing the vasculature by injecting silicone rubber compound and providing clear visual guidance for measuring changes in blood vessel size.

Uma abordagem visual para induzir dolicoectasia em camundongos para modelar disfunção cerebrovascular mediada por grandes vasos

The blood-brain (BBB) is a crucial system that regulates selective brain circulation with the periphery, as an example, allowing necessary nutrients to ...

En Face Preparação de Vasos Sanguíneos de Rato

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Modelo Spinotrapezius murino para avaliar o impacto da ligadura arteriolar em função microvascular e Remodelação

Vasodilatação de isolado navios e o isolamento da matriz extracelular do Mice Tight-pele

Purificação de embarcações do cérebro do rato

Visualização 3D de pericitos vasculares da retina em camundongos por imunocoloração

Visualização 3D de pericitos vasculares da retina em camundongos por imunocoloração

Visualização 3D de pericitos vasculares da retina em camundongos por imunocoloração

Etapas de preparação para medição de reatividade no Mouse arteríolas retina Ex Vivo

Avaliando a angiogênese terapêutica em um modelo murino de isquemia Retromembro

Uma abordagem visual para induzir dolicoectasia em camundongos para modelar disfunção cerebrovascular mediada por grandes vasos

Uma abordagem visual para induzir dolicoectasia em camundongos para modelar disfunção cerebrovascular mediada por grandes vasos