وتدعم الأنشطة البحثية للمؤلفين من المنح المقدمة من المعهد الوطني للصحة للدكتور آبي (هل-130193، هل-123346، هل-118462، هل-108551).

تمت الموافقة على البروتوكولات للفأر ربط الشريان السباتي الجزئي والعزل من الشريان الأورطي الماوس والشريان السباتي ل إن مواجهة إمونوستينينغ من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (إبت 2014-9231). 1. اليسار الأيسر الشريان السباتي ربط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الفضاء الجراحي عن طريق وضع 12 بوصة × 14 بوصة وسادة التدفئة على الطاولة وتغطية لوحة وطاولة الجدول مع ثنى الجراحية نظيفة كبيرة. ضبط الذراع من موقف الطفرة بحيث مجال الرؤية ستيريوميكروسكوب في منطقة وسط لوحة التدفئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قم بتشغيل وسادة التسخين على الطاولة وقم بتعيين قرص التحكم ذو 3 أوضاع على مستوى الحرارة المتوسط. في هذا الإعداد درجة الحرارة، سطح المجلس الجراحي (انظر 1.6.1) سيكون 38-40 درجة مئوية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قفص نظيفة على وسادة التدفئة أخرى. بدوره وسادة التدفئة على النحو الوارد أعلاه. سيتم استخدام هذا القفص للشفاء بعد الجراحة (انظر 1.16) وكذلك السكن. </li></ol></lط&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الطاولة الجراحية، ضع الحقيبة التعقيم تعقيمها التي تحتوي على مقص القزحية (1 زوج)، ملقط الأنسجة (1 زوج)، ملقط السوبر قبضة (2 أزواج)، مقص الربيع (1 زوج)، ضام حادة (1 زوج؛ 2.5 مم واسعة) ، جولة التعامل مع حامل إبرة (1)، تعقيم 6-0 خياطة الحرير، القطن يميل تطبيقها، مصغرة القطن يميل قضيب، الستائر الجراحية، و 2 &quot;x 2&quot; الإسفنج الشاش. أيضا وضع زجاجة الضغط تحتوي على 70٪ من الإيثانول وآخر يحتوي على كلوروهيكسيدين الجراحية سركبون الجدول الجراحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن الماوس. هناك حاجة إلى وزن الجسم لتحديد كمية مناسبة من تسكين، والتي سوف تدار على الفور قبل الجراحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس في غرفة الاستقراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على خزان الأكسجين والمذاذ مخدر من أجل تخدير الماوس في غرفة الاستقراء. الحفاظ على مستوى الأيزوفلورين في 2٪. يستغرق 3-5 دقائق قبل توقف الماوس تتحرك. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن الماوس يجري أنسثتيزد، وضع قطعة أصغر من ثنى الجراحية العقيمة (24 بوصة × 24 بوصة) تحت ستيريوميكروسكوب لخلق سطح الجراحية. ثم ضع لوحة الجراحية الاكريليك (التي تم تنظيفها مع الكحول 70٪) على سطح رايات. ولذلك ينبغي أن يكون المجلس الجراحي على وسادة التدفئة ولكن مفصولة طبقتين من الستائر الجراحية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتوقف الماوس تتحرك في غرفة الاستقراء، ونقل الماوس إلى منطقة إعداد ما قبل الجراحية وموقف أنفه في مخروط الأنف متصلا المرذاذ (2٪ إيسوفلوران). إزالة الشعر حول منطقة عنق الرحم باستخدام الانتهازي الكهربائية أو الشعر مزيل محلول. نوصي إزالة الشعر محلول لأن هذه الطريقة لن تنتج فضفاضة قطع الشعر، والتي يصعب إزالة تماما من منطقة الجراحية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع مخروط الأنف في مكان، حرك الماوس إلى لوحة الجراحية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشريط أسفل اليمين واليسار الصدارة الكفوف إلى لوحة الجراحية. شريط أسفل كل من الساقين الخلفيةثير على الجانب الأيمن من الماوس. وهذا يسبب دوران طفيف من الجسم الفأر بحيث يصبح الجانب الأيسر من منطقة الرقبة من الماوس أفضل وضع لعملية جراحية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطهير منطقة شق مع الكحول 70٪، الكلورهيكسيدين فرك الجراحية، ومرة ​​أخرى مع الكحول 70٪. تغطية الماوس مع ثنى الجراحية معقمة باستثناء منطقة شق عنق الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد أخمص القدمين قرصة أن الماوس هو تخدير كامل ويعطي تسكين (كابروفين 3-5 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن داخل الصفاق أو تحت الجلد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر تشريح، وجعل شق خط الوسط بطني حول منطقة عنق الرحم باستخدام إما مشرط أو مقص القزحية. ملاحظة: نحن نستخدم مقص لأن مسافة العمل من ستيريوميكروسكوب محدودة، مما يجعل من الصعب استخدام مشرط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشف الشريان السباتي المشترك الأيسر (لسا) عن طريق دفع جانبا وإعادة وضع الغدد اللعابية التي تغطي الأوعية الدموية إلى الجانب الأيسر مننيمال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد جميع الأوعية الدموية في مجال العمليات الجراحية ( الشكل 1 ). لسا تشعب في الشريان السباتي الداخلي الأيسر (إيكا) والشريان السباتي الخارجي الأيسر (إيكا). الشريان الدرقي السطحي (ستا) ينشأ من اللجنة الاقتصادية لأفريقيا على الجانب الإنسي. الشريان القذالي (أوا) عادة ما تنشأ من اللجنة الاقتصادية لأفريقيا، ولكن في بعض الفئران أنه ينشأ من إيكا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليغات جميع فروع الشريان باستثناء أوا باستخدام تعقيم 6-0 خياطة الحرير. لتحقيق ذلك، وجعل ربط اثنين التالية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بلطف النسيج الضام حول وتحت الشريان السباتي الداخلي الأيسر (إيكا). الاستيلاء على قطعة من قبل خياطة 6-0 الحرير (~ 2.5 سم) مع ملقط وتمريره تحت الشريان. باستخدام زوج آخر من ملقط، وسحب خياطة تقريبا 1/3 من طوله ويغات الشريان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة النسيج الضام حول الشريان السباتي الخارجي الأيسر (إيكا) في نفس الطريقة المذكورة أعلاه وجعل ربط القريبة إلى الأيسر متفوقة الدرقيد الشريان (ستا) ( الشكل 1 ). يجب الحرص على عدم تلف الألياف العصبية التي تعمل داخل المجال الجراحي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تم إجراء هذه عمليات الربط، والعودة الغدد اللعابية إلى الوضع الأصلي وهيدرات الحقل الجراحي عن طريق وضع 2-3 قطرات من محلول ملحي معقم. إغلاق الجلد باستخدام خيوط المغلفة فيكريل 6-0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الجراحة، ضع الماوس في قفص ما قبل تحسنت (انظر 1.2.1). الماوس يجب أن يستيقظ في غضون 5 دقائق والبدء في التجول. وأكد مرة واحدة أن الماوس يتصرف بشكل طبيعي، وجلب القفص إلى غرفة السكن الحيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة الماوس يوميا لمدة 3 أيام الأولى من الانتعاش. الماوس يمكن أن تبقى طالما تتطلب التجربة في ظل مختلف الظروف التي يدعو البروتوكول التجريبي ل. إن وجه الاستعدادات يمكن أن يتم في أي وقت بعد الجراحة. </li></ol> 2. إن الوجه إمونوستينينغ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس مع كو 2 عن طريق الاستنشاق جرعة زائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">شريط الماوس في مستلق (الجانب البطن حتى) موقف على لوحة تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح تجويف البطن عن طريق إجراء شق خط الوسط باستخدام مقص القزحية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح تجويف الصدري عن طريق قطع الأضلاع أفقيا إلى القص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل نيك في الوريد الأجوف أو قطع واحدة من الشرايين الفخذية لاستنزاف الدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج إبرة 26 G تعلق على الإعداد نضح الجاذبية (120 سم ضغط المياه) في قمة البطين الأيسر وإرواء الدورة الدموية مع محلول ملحي يحتوي على الهيبارين (40 U / مل). مواصلة نضح حتى يصبح المالحة المتدفقة من قطع يصبح واضحا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبديل نظام نضح من المياه المالحة إلى حل التثبيت تحتوي على بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني (الفوسفات مخزنة المالحة)، ومواصلة بيرفوسينغ لمدة 5 دقائق أكثر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الشريان الأورطي وكل من الشرايين السباتية اليسار واليمين باستخدام مقص نهاية حادة والملقط، ومكان في أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على تثبيتي على الجليد. </li><li&gt; نقل السفينة إلى طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني تحت المجهر تشريح، وإزالة بعناية الدهون والأنسجة الضامة تعلق على الشريان الأورطي والشريان السباتي. فصل وتقسيم الشريان الأورطي والشريان السباتي طوليا لفضح البطانة ( الشكل 2 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كل سفينة بشكل منفصل إلى بئر من لوحة 12 جيدا تحتوي على 0.5 مل من محلول بيرمابيليزينغ (0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني) لكل بئر. بيرمابيليز الأوعية الدموية لمدة 10 دقيقة مع هزاز في درجة حرارة الغرفة (رت). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل لفترة وجيزة مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمنع المواقع غير محددة الأجسام المضادة ملزمة، احتضان الأوعية الدموية في مصل طبيعي 10٪ من الأنواع الحيوانية التي تم إجراء الأجسام المضادة الثانوية، في تبس (تريس مخزنة المالحة (تبس) مع 2.5٪ توين 20) لمدة 30 دقيقة مع هزاز في رت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان السفن مع الأجسام المضادة الأولية المخفف بشكل مناسب في تبس مع 10٪ مصل طبيعي (كما هو موضح أعلاه) بين عشية وضحاها مع هزاز في 4 درجات مئوية. المستوىمن التخفيف يجب أن تحدد لكل الأجسام المضادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء تلطيخ التحكم التالية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان السفن مع تبس بدلا من الأجسام المضادة الأولية تليها الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان السفن مع تبس التي تحتوي على غير المناعة (أو قبل المناعة) المصل أو إيغ من نفس الحيوان (الأنواع) التي تم إجراء الأجسام المضادة الأولية، تليها الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حذف الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية. يجب التعامل مع هذه العينات السيطرة بنفس الطريقة، وفي الوقت نفسه عندما يتم تنفيذ تلطيخ مع الأجسام المضادة المحددة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأوعية الدموية 3 مرات مع تبس لمدة 10 دقيقة مع كل هزاز في رت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع فلورزنتلي المسمى الأجسام المضادة الثانوية المخفف بشكل مناسب في تبس مع 10٪ مصل طبيعي (كما هو موضح أعلاه) لمدة 1 ساعة مع هزاز في رت. تلطيخ النووي مع دابي (4 &#39;، 6-دياميدينو-2-فينيليندول) يمكن إجراء في وقت واحدt هذه المرحلة عن طريق إضافة 1 / 5،000 من حجم وحدة التخزين دابي الحل الذي يحتوي على 5 ملغ / مل من دابي في H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل 3 مرات مع تبس لمدة 10 دقيقة مع كل هزاز في رت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة واحدة من كاشف المضادة للتلاشى على غطاء الزجاج (22 مم × 50 مم) ووضع الأوعية الدموية على الزجاج غطاء مع بطانة الأوعية الدموية لأسفل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع زجاج الشريحة (22 مم × 75 ملم) على الأوعية الدموية مع تجنب فقاعات محاصرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشريحة على مسح مختبر نظيفة ( مثل كيمويب) وتغطية الشريحة مع قطعتين من مختبر مسح. ضع بلطف 3.5 كجم من الوزن (على سبيل المثال استخدام زجاجة من الماء على كتاب سميك.) على الشريحة لمدة أقصاها 5 دقائق لتسطيح عينة وجه الأوعية الدموية إن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الوزن ومسح الحل الزائد من جميع أنحاء ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق طلاء الأظافر في زوايا 4 ساترة، ووضع الشرائح في مربع الشريحة، ساترة الجانب حتى، والحفاظ في الظلام في رت(أو 4 درجات مئوية) بين عشية وضحاها. هذه العملية تتسطح الأنسجة أكثر ويجعل من الأسهل للقيام المجهري في تكبير عالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم ساترة تماما باستخدام طلاء الأظافر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء المجهري بمجرد طلاء الأظافر جافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر، وتخزين الشرائح في -20 درجة مئوية. </li></ol>

<ol>
	<li>Jelev, L., Surchev, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+simple+technique+for+en+face+endothelial+observations+using+water-soluble+media+-'thinned-wall'+preparations.">A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -'thinned-wall' preparations.</a> J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).</li><li>Neill, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+on+venous+endothelium+of+alterations+in+blood+flow+through+the+vessels+in+vein+walls,+and+the+possible+relation+to+thrombosis.">The effect on venous endothelium of alterations in blood flow through the vessels in vein walls, and the possible relation to thrombosis.</a> Ann Surg. 126 (3), 270-288 (1947).</li><li>Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+examining+the+endothelial+cytoskeleton+in+situ+using+immunofluorescence.">A method for examining the endothelial cytoskeleton in situ using immunofluorescence.</a> J Histochem Cytochem. 11 (11), 1317-1320 (1983).</li><li>Poole, J. C. F., Sanders, A. G., Florey, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regeneration+of+aortic+endothelium.">The regeneration of aortic endothelium.</a> J Pathol Bacteriol. 75, 133-143 (1958).</li><li>Sade, R. M., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=En+face+stripping+of+vascular+endothelium.">En face stripping of vascular endothelium.</a> Microvasc Res. 4, 77-80 (1972).</li><li>White, G. E., Gimbrone, M. A., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+expression+of+stress+fibers+in+vascular+endothelial+cells+in+situ.">Factors influencing the expression of stress fibers in vascular endothelial cells in situ.</a> J Cell Biol. 97 (2), 416-424 (1983).</li><li>Kim, D. W., Gotlieb, A. I., Langille, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+modulation+of+endothelial+F-actin+microfilaments+by+experimental+alterations+in+shear+stress.">In vivo modulation of endothelial F-actin microfilaments by experimental alterations in shear stress.</a> Arteriosclero. 9, 439-445 (1989).</li><li>Haka, A., Potteaux, S., Fraser, H., Randolph, G., Maxfield, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+monocyte+subpopulations+in+murine+atherosclerotic+plaques+by+multiphoton+microscopy.">Quantitative analysis of monocyte subpopulations in murine atherosclerotic plaques by multiphoton microscopy.</a> Plos ONE. 7 (9), 244823e (2012).</li><li>Ch&#232;vre, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+imaging+of+intravascular+atherogenic+inflammation+in+live+mice.">High-Resolution imaging of intravascular atherogenic inflammation in live mice.</a> Circ Res. 114, 770-779 (2014).</li><li>Heo, K. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbed+flow-activated+p90RSK+kinase+accelerates+atherosclerosis+by+inhibiting+SENP2+function.">Disturbed flow-activated p90RSK kinase accelerates atherosclerosis by inhibiting SENP2 function.</a> J Clin Invest. 125 (3), 1299-1310 (2015).</li><li>Le, N. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crucial+role+for+p90RSK-mediated+reduction+of+ERK5+transcriptional+activity+in+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis.">A crucial role for p90RSK-mediated reduction of ERK5 transcriptional activity in endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> Circ. 127, 486-499 (2013).</li><li>Kano, Y., Katoh, K., Masuda, M., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+composition+of+stress+fiber-plasma+membrane+attachment+sites+in+endothelial+cells+in+situ.">Macromolecular composition of stress fiber-plasma membrane attachment sites in endothelial cells in situ.</a> Circ Res. 79, 1000-1006 (1996).</li><li>Nigro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophilin+A+is+an+inflammatory+mediator+that+promotes+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-dependent+mice.">Cyclophilin A is an inflammatory mediator that promotes atherosclerosis in apolipoprotein E-dependent mice.</a> J Exp Med. 208 (1), 53-66 (2011).</li><li>Mattson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+arterial+blood+pressure+in+different+strains+of+mice.">Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice.</a> Am J Hypertens. 14 (5), 405-408 (2001).</li><li>Jinguji, Y., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+fiber+dependent+axial+organization+of+fibronectin+fibrils+in+the+basal+lamina+of+the+chick+and+mesenteric+artery.">Stress fiber dependent axial organization of fibronectin fibrils in the basal lamina of the chick and mesenteric artery.</a> Endothelium. 2, 35-47 (1994).</li><li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Lust, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+tissue+clearing+(PACT):+Technical+evaluations+and+new+perspectives+in+immunofluorescence,+histology,+and+ultrastructure.">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluations and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Sci Rep. 6, 34331 (2016).</li></ol>

لا شيء

عند التعامل مع الأوعية الدموية الماوس، من المهم أن نتذكر أن البطانة الهشة وأن أي قوة ميكانيكية مفرطة سوف تلحق الضرر الخلايا البطانية. على سبيل المثال، الخلايا البطانية كسر أو فصل من جدار الوعاء الدموي إذا كان بيرفوسد السفينة بشكل قوي جدا، والتي يمكن أن يحدث بسهولة ع?...

للدراسات النسيجية بواسطة المجهر الضوئي، يتم معالجة قطع ثلاثية الأبعاد من الأنسجة البيولوجية بشكل روتيني لتضمين البارافين تليها باجتزاء وتلطيخ. عينة الأنسجة التي تم البارافين جزءا لا يتجزأ قد تكون عدة مليمترات في جميع الأبعاد الثلاثة. ومع ذلك، لغرض المجهر الضوئي، يجب أن يكون مقطوع أولا بحيث الضوء يمكن أن تمر ومن ثم ملطخة بحيث قسم رقيقة ينتج تباين كاف للتصوير. لأن العينات المقسمة عادة ما تكون 5-10 ميكرون في سمك، واحد يرى سوى جزء صغير جدا من العينة بأكملها في بعدين في وقت واحد. فمن الممكن لجمع المقاطع متتابعة، وبعد التصوير كل قسم على حدة، إجراء إعادة بناء بمساعدة الكمبيوتر من الصور 3D، ولكن هذا هو عمل شاق في الواقع. التشريح المرضي للأوعية الدموية، وخاصة لدراسة التسبب في تصلب الشرايين، ويعرض مشاكل فريدة من نوعها. تصلب الشرايين هو مرض متطور يتطورمحليا في المناطق التي يحدث فيها تدفق الدم المضطرب. وعلاوة على ذلك، يبدأ المرض داخل البطانة، وهو نسيج رقيق يتكون من أحادي الطبقة من الخلايا البطانية والمصفوفة خارج الخلية، من الشرايين الكبيرة. لهذه الأسباب، فإنه من الصعب تحديد ودراسة الآفات المبكرة باستخدام الأوعية الدموية مقطوع لأنه يمكن للمرء أن يغيب بسهولة باجتزاء الآفة. حتى إذا كان القسم لا يشمل منطقة مريضة، واحد سوف نرى فقط 5-10 ميكرون جزء يحتوي على الخلايا البطانية وغيرها من خلايا جدار الأوعية الدموية في وسائل الإعلام والدفنتية. كل جبل إن وجه (وضوحا än فاس) الاستعدادات تسمح لنا لمسح مساحة واسعة من سطح الأوعية الدموية مثل الشريان الأورطي بأكمله من الجذر الأبهر على طول الطريق وصولا الى الشرايين الحرقفية المشتركة. باستخدام مثل هذه العينة ملطخة الأجسام المضادة محددة وتحقيقات محددة أخرى، يمكن للمرء تحديد موقع الآفات وأيضا حيث تحدث الأحداث الجزيئية المختلفة في الخلايا البطانية بالتزامن وايالتصلب العضلي مثل التغيرات في التعبير، والتعريب، والتعديلات بوستترانزلاتيونال من البروتينات. بالإضافة إلى دراسة تصلب الشرايين، يتم استخدام شكل الخلايا البطانية لوحظ في الاستعدادات وجه إن كمؤشر على نمط تدفق الدم في المتوسط ​​الوقت الإقليمي. هذه البيانات مهمة لدراسة ميكانوسينالينغ من الخلايا البطانية في الموقع. لهذا الغرض، الروتينية الأنسجة المقطعية الأوعية الدموية المقطعية ليست مفيدة. وهكذا، بالنسبة لطب الأوعية الدموية وعلم الأحياء، فمن المهم بشكل خاص للحصول على تقنية لصنع إن وجه استعدادات الأوعية الدموية التي تسمح للمرء أن نلاحظ مساحة واسعة من سطح السفينة وكذلك المناطق تحت السطحية أعمق من السفينة. كما استعرضها جيليف وسورشيف 1 ، وقد وضعت علماء الأحياء الأوعية الدموية أساليب مختلفة لمراقبة بطانة الأوعية الدموية في وجهه. وقد وضعت بعض الأساليب بارعة في 1940 و 1950. باستخدام هذه الأساليب، كانت<html> قادرة على دراسة التنظيم الأساسي للخلايا البطانية التي خط السطح الداخلي للأوعية الدموية. ومع ذلك، بسبب الطريقة التي تواجهها هذه المستحضرات التحضيرية (ما يسمى طريقة هوتشن 2 ، 3 ، 4 أو تقشير قبالة سطح السفينة 5 ) والطريقة التي تلطخ العينة، لم يكن من الممكن دائما للحصول على المورفولوجية دون انقطاع المعلومات من سطح السفينة إلى المناطق الأعمق من جدار الأوعية الدموية. كله جبل أون وجه إعداد وعاء جنبا إلى جنب مع تلطيخ المناعي سمح لنا ليس فقط دراسة مورفولوجيا الخلايا البطانية والتعبير البروتين وتوطين في هذه الخلايا، ولكن أيضا لتوسيع هذه الدراسات إلى المنطقة تحت البطانية من جدار الوعاء الدموي. الدراسات المبكرة باستخدام الأوعية الدموية أر تواجه الاستعدادات الملون إمونوفلوريسنتلي بدأت تظهر في عام 1980 6 ،f &quot;&gt; 7. مع ظهور المسح بالليزر المجهر متحد البؤر ومؤخرا المجهر مولتيبوتون، يمكن للمرء الآن الحصول على صور واضحة في التركيز من هيكل جدار الأوعية الدموية في عينات من عينات ملون إونوفلورزنتلي في وعاء وكذلك شبكة الأوعية الدموية في الحيوانات الحية 8 ، 9 ، 10 ، 11. هذه تقنيات التصوير القائم على الكمبيوتر تخلق في التركيز الصور المقسمة البصرية، ومن خلال التراص مثل هذه الصور، يمكن للمرء الحصول على صور 3D أعيد بناؤها من جدار الوعاء الدموي وشبكة الأوعية الدموية في الأنسجة، يمكن أن تولد صورا لقسم المحرز على طول المحور Z للصورة أعيد بناؤها 12 ، 13 . في هذه المقالة، ونحن سوف توضيح طريقة لإعداد إن وجه الاستعدادات من الشريان الأورطي الماوس والشريان السباتي لتلطيخ إمونوفلورسنت. إن وجه الاستعداداتيمكن أن يتم حتى بعد أن تم التلاعب هذه السفن تجريبيا. على سبيل المثال، يمكن أن يكون الشريان السباتي ليغاتد جزئيا ثم إعداد وجه إن بعد هذه الجراحة. لهذا السبب، ونحن سوف تصف أيضا في هذه المقالة كيف نفعل ربط جزئي على الشريان السباتي. وبالمقارنة مع الاستعدادات المماثلة من الحيوانات الكبيرة مثل الفئران والأرانب والبشر، فإن سفن الفأر صغيرة الحجم وأكثر هشاشة، مما يتطلب مزيدا من الرعاية للمناولة أثناء العزلة الجراحية للسفن وإعدادها لتلطيخ الأجسام المضادة والمجهر. لأن النموذج الحيوان الأكثر استخداما لتعديل وراثي هو الماوس، يصبح من الأهمية بمكان للعديد من المحققين للتعامل مع الأوعية الماوس دون الإضرار بها. في هذه المخطوطة، ونحن سوف تصف كيفية التعامل مع الأوعية الدموية الماوس عند صنع الاستعدادات وجهه من الشريان الأورطي الماوس والشريان السباتي. لغرض مظاهرة، سوف نستخدم البرية نوع C57 / B6 الفئران.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500ml bag</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9788429</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12556005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 coated vicryl suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J833G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF488 goat anti-rat IgG&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF546 goat anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11035</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD144 (Ve-Cad)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD555289</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG</td>
			<td>Santa Cruze Biotechnology</td>
			<td>Sc-8304</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aoto Flow System</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>EZ-AF9000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave Wrap. 24x24in</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>4024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt retractors, 2.5mm wide</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18200-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caprofen (Rimadyl)&#160;</td>
			<td>zoetis</td>
			<td>NADA#141-199</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine Scrub, 2%</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>RXCHLOR2-PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curity gauze sponges 2x2</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>KC2146</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric heating pad, 12X14</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0667724</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11152-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass 22x50mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393059</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>GS05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Solution 4% in PBS</td>
			<td>Santa Cruze Biotechnology</td>
			<td>SC-281692</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes 100x15mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade mountant with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P-36935</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puritan cortton swabs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10806-005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puritan Mini cotton tipped aplicators</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82004-050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round handled Needle Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12076-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk Suture 6/0</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strabismus Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14075-09</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Grip Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00649-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent Dressing</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>TD-26C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-1000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC327371000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

en face preparation of mouse blood vessels

يتم استخدام أجزاء من الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين بشكل روتيني لدراسة الأنسجة الأنسجة والتشريح المرضي. ومع ذلك، فإنه من الصعب تحديد ما هو مورفولوجيا الأنسجة ثلاثية الأبعاد من هذه المقاطع. وبالإضافة إلى ذلك، فإن أقسام الأنسجة فحصها قد لا تحتوي على المنطقة داخل الأنسجة اللازمة لغرض الدراسة الجارية. هذا الحد الأخير يعوق الدراسات النسيجية للأوعية الدموية منذ الآفات الوعائية تتطور بطريقة محورية. وهذا يتطلب طريقة تمكننا من مسح مساحة واسعة من جدار الأوعية الدموية، من سطحه إلى مناطق أعمق. كامل جبل إن وجه إعداد الأوعية الدموية يستوفي هذا الشرط. في هذه المقالة، ونحن سوف تثبت كيفية جعل الاستعدادات وجهه من الشريان الأورطي الماوس والشريان السباتي و إمونوفلورزنتلي وصمة عار لهم للمجهر متحد البؤر وأنواع أخرى من التصوير القائم على مضان.

ويظهر نموذجي أر وجه المناعي من البطانة في الشكل 3 . تظهر هذه الصورة مقطع بصري واحد من الشريان الأورطي الماوس اتخذت قرب افتتاح الشريان الوربي (منطقة كبيرة على شكل بيضة مظلمة). كان الشريان الأبهر ملطخة المزدوج مع مكافحة في كادهيرين (الأخضر) ومك...

Watch this Scientific Journal Video about En Face Preparation of Mouse Blood Vessels at JoVE.com

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

ويرد وصف لإجراء صنع الاستعدادات وجهه من الشريان السباتي الماوس والشريان الأبهر. هذه الاستعدادات، عندما ملطخة إمونوفلورزنتلي مع الأجسام المضادة محددة، تمكننا من دراسة توطين البروتينات وتحديد أنواع الخلايا داخل جدار الأوعية الدموية بأكمله من قبل المجهر متحد البؤر.

في إعداد الوجه من ماوس سفن الدم

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...

en-face-preparation-of-mouse-blood-vessels

Research

JoVE Journal

Biology

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

20.8K Views.  University of Texas MD Anderson Cancer Center.  ويرد وصف لإجراء صنع الاستعدادات وجهه من الشريان السباتي الماوس والشريان الأبهر. هذه الاستعدادات، عندما ملطخة إمونوفلورزنتلي مع الأجسام المضادة محددة، تمكننا من دراسة توطين البروتينات وتحديد أنواع الخلايا داخل جدار الأوعية الدموية بأكم?...

Video: En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

التحضير للثقافات ماوس العصبية القشرية نأت

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

في الجسم الحي التصوير والعلاجات العلاجية في الفأر نموذج مثلي من سرطان المبيض

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

العزلة والثقافة في الخلايا البطانية الرئوي من الفئران حديثي الولادة

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

العزلة والثقافة من الماوس الأساسي خلايا البنكرياس عنيبية

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

قياس النفاذية في واحدة Microvessel المعزولة الجرذ إعداد الرئة perfused الدم

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

المناعي غير المباشر على أقسام المجمدة من الماوس الغدة الثديية

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

أون كشف الوجه من اكسيد النيتريك وفوق الأكسيد في طبقة بطانة الأوعية الدموية من شرايين سليمة

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

البروتينات التحليل المناعي من الداخلية والخارجية السنترومير-الحيز الحركي

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on the surface of slides (rather than dropping them from a height), we demonstrate an optimized technique on mouse spermatocytes that was first described in 1997. This method is widely used in laboratories to study mammalian meiosis because it yields a plethora of high quality nuclei undergoing substages of prophase I. Seminiferous tubules are first placed in a hypotonic solution to swell spermatocytes. Then spermatocytes are released into a sucrose solution to create a cell suspension, and nuclei are spread onto fixative-soaked glass slides. Following immunostaining, a diversity of proteins germane to meiotic processes can be examined. For example, proteins of the synaptonemal complex, a tripartite structure that connects the chromosome axes/cores of homologs together can be easily visualized. Meiotic recombination proteins, which are involved in repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination, can also be immunostained to evaluate progression of prophase I. Here we describe and demonstrate in detail a technique widely used to study mammalian meiosis in spermatocytes from juvenile or adult male mice.

Meiosis is the developmental process by which gametes are formed through a single round of DNA replication and two successive rounds of chromosome segregation. Mammalian meiosis can be examined by utilizing a technique to prepare meiotic chromosome spreads. Here, we demonstrate a method of preparing surface-spread nuclei from mouse spermatocytes.

إعداد كروموسوم هو ينتشر من الماوس سبيرماتوسيتيس

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

حقن الخلية الداخلية عبر كتلة من الخلايا الجذعية الجنينية يؤدي إلى ارتفاع في أسعار تشيميريسم

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...