הדמיה חיה וניתוח של התכווצויות שרירים בתוך העובר דרוזופילה

שיטה זו עוסקת כיצד לנתח תהליכים התפתחותיים כגון התכווצויות שרירים וגלגול המתרחשים בעובר Drosophila. כמה יתרונות של טכניקה זו הם שזה פולשני ומפורט למדי, עדיין זה פשוט יחסית לבצע. השיטה שלנו יכולה להיות מפותחת עוד יותר עבור סינון מבוסס ניתוח תוכן גבוה כדי לבודד ולנתח מוטציות חדשות המשפיעות על התכווצויות שרירים עובריים ותהליכים התפתחותיים אחרים.

כאשר מדמיינים התכווצויות שרירים, חשוב לתזמן כראוי אוספי עוברים מכיוון שההתכווצים מתחילים רק בשלב התפתחותי ספציפי. הדגמה חזותית צעד אחר צעד יכולה לסייע רבות בניתוח הכמותי של התהליכים ההתפתחותיים. להדמיה חיה של עוברי דרוסופילה רכובים, מניחים את העוברים על הבמה של מיקרוסקופ epifluorescence עם פונקציית timelapse ומצלמה דיגיטלית עם מסנני פליטה מתאימים ובחרו עדשה אובייקטיבית טבילת מים 10X.

ואז וידאו חי להקליט את העוברים באמצעות תוכנת הקלטת מיקרוסקופ המתאים במשך כשעה עד שעתיים עם קצב רכישה של ארבע מסגרות לשנייה. בסוף הניסוי, לייצא את הווידאו המוקלט ישירות לתוך ImageJ. בחר תמונה וחיתוך כדי לצייר תיבה סביב כל עובר בודד כדי לחתוך את הקלטות הווידאו לגודל של כל עובר.

לחצו על 'תמונה', 'שינוי צורה' ו'סובב' כדי לסובב את התמונות החתוכה כדי להגיע למיקום אנכי של קו האמצע של העובר ביחס למסך. כדי להגדיר מידות מרחק למיקרומטרים, לחץ על נתח והגדר קנה מידה ולאחר מכן הזן את גורם ההמרה הידוע של יחס פיקסל למיקרון עבור הגדרת המיקרוסקופ. כל המדידות הבאות ידווחו לאחר מכן במיקרומטרים.

כדי לנתח את גלגול העובר, סמן תחילה את המיקום של קנה הנשימה של עובר אחד או את שניהם במסגרת הראשונה של הווידאו באמצע הדרך בין הקצוות האחוריים והמנייניים ולחץ על נתח, כלים ואזור של מנהל עניין. צייר תיבת שבעה מיקרומטר בקירוב על-ידי שבעה מיקרומטר מסביב קנה הנשימה ולחץ על מקש T בלוח המקשים כדי לתעד מיקום זה כמתאם XY. סמן את המיקום של אותו אזור של קנה הנשימה לאחר התכווצויות פריסטואליות של עניין ולצייר קו המחבר את המרכזים של כל תיבה לחיצה על M על המקלדת כדי למדוד את המרחק מעמדת טרום התכווצות למצב שלאחר התכווצות.

כדי לנתח התכווצויות שרירים עובריות באמצעות עוברים המבטאים סמני שריר פלואורסצנטיים, השתמש בהקלטת הקריאה הפלואורסצנטית כדי לצייר אזור עניין שבמרכזו שרירי הפלואורסצנטיות של קטע גוף מסוים של עניין. בחר בכרטיסיה הוספת T במנהל אזור העניין כדי לתעד את מיקום אזור העניין. לחץ על אזור מנהל העניין ולמדוד כדי לתעד את עוצמת הפלואורסצנטי הממוצעת של כל אזור עניין שנבחר עבור כל מסגרת של הסרטון.

העבר את התיבה למרכזי מקטעי גוף אחרים של עניין ולחץ על הוסף T כדי לתעד את מיקומם כדי לקבל אזורים בעלי עניין זהה בכל מקטעי הגוף שיש לנתח. במנהל אזור העניין, החזק את מקש בקרה לחוץ בעת בחירת כל אזורי העניין שנרשמו כנקודות ציון של XY. לחץ על More ו- Multi-Measure כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של כל אזור מעניין עבור כל המסגרות של הווידאו.

פעולה זו תדווח על כל מדידה בטבלה עם כל אזור מעניין כעמודה בטבלה וכל מסגרת כשורה. לאחר מכן העבר את הטבלה לתוכנית גיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נוסף. התווה גרף עם מספר המסגרת על ציר ה- x ועוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת בציר ה- y והמרת מספר המסגרת לזמן באמצעות ארבע המסגרות לשנייה.

התכווצויות השרירים מגבירות את עוצמת ה-GFP כשהן מביאות יותר GFP לסביבה של אזור המוקד ככל שיותר שרירים נמשכים פנימה במהלך התכווצויות אלה. כדי לקבוע את משרעת התכווצות השריר, להעריך את עוצמת GFP הבסיסית כעוצמה הממוצעת של האזורים בין פסגות. לאחר מכן להעריך את העלייה בעוצמת פלואורסצנטיות GFP יחסית לקו בסיס זה.

לאחר מכן חלקו כל אזור בעל ערך עוצמת ריבית בעוצמה הבסיסית כדי לנרמל את עוצמת GFP לקו הבסיס. השווה את התעצמויות GFP מנורמל בחלקים האחוריים, המדיאליים והפנימיים במהלך גל התכווצות השרירים כדי לבחון את השינויים בהיקף התכווצות השרירים ככל שהגל יתפשט ולקבוע את כיוון הגל. כדי להשוות את התכווצויות השרירים בצד שמאל ויימין של העובר, לנתח את התעצמות השיא עבור אותם מקטעים משני צידי העובר.

השתמש משרעת התכווצות ואת העיתוי של הפסגות כדי לחשוף את ההבדלים, אם בכלל, ואת היקף ואת העיתוי של גלי התכווצות שרירים פריסטואלית. כאן התכווצויות שרירים פריסטואליות נורמליות בסוג פראי של עובר דרוסופילה מוצגות. בסרטון זה של גלגול בעובר מסוג פראי, שים לב כי התוספת הגבית אינה זזה בעוד קנה הנשימה עושה המציין כי העובר התגלגל בתוך הקליפה שלה.

בניתוח מייצג זה, התכווצות השרירים מגיעה לשיאה במהלך תקופת הזמן של 165 עד 178 שניות מייצגת גל קדמי יחיד. עבור עובר זה, אין הבדל משרעת ואת הזמן של התכווצויות השריר נמדד על הצדדים הימניים והשמאליים של העובר. התכווצות פריסטואלית מוגדרת כגל קדמי מסוג אחד אם הפרופיל שלו הוא שיא המתעורר באזור האחורי ואחריו פסגות באזורים האמצעיים והקדום.

גל אחד מסוג אחורה הוא שיא המתעורר תחילה במקטעים לפנים ולאחר מכן מתפיץ לכיוון אזורים אחוריים. סוג שני גלים מתחילים בקצה אחד של העובר ומתקדם לכיוון האזורים האמצעיים לפני שהם חוזרים למקורם כגל גורף שיזם מחדש בקצה הנגדי. עוברים מוטנטים יציבת הגוף להדגים תדירות יחסית חריגה של סוג אחד לסוג שני גל הדור שתביאים חריגות יציבת הגוף המיועד פיתיון הגוף או פנוטיפ סיבוב.

כדי להשתמש פלואורסצנטיות כקריאת הפרמטרים התכווצות שריר, זה חיוני כדי להשתמש בעוברים עם כתב ברקמת השריר. שיטה זו יכולה לשמש להקלטה בו זמנית של התכווצויות השרירים של עוברים רבים ולהערכת התגובות לגירויים שונים, תרופות או שינויים סביבתיים.