ההשתלה אורתוטופית של תאי אדנוקרצינומה של ריאות עכבר למקבלי השתלים הסינגניים מאפשרת לחקור גידולים בנוכחות מערכת חיסונית פעילה לחלוטין בתנאים פיזיולוגיים. כמובן, הגידולים מתפתחים לעכברים אימונואיים וזה הרבה יותר פיזיולוגי שאם אתה מבצע השתלה בעכברים immunodeficient. עריכת גנים של תאי הגידול לפני ההשתלה הופכת מודל זה לגישה ישירה וחוסכת זמן לחקר ההשפעה של גורמים גנטיים על צמיחת הגידול ופרופילי ביטוי הגנים.
בהשוואה למודלים גידול ריאות אוטוכטוני בלתי ניתנים לעיכול, שיטה זו נמנעת הרבייה הנרחבת של עכברים, ולכן מייצג עידון של מודלים קודמים של עכבר סרטן ריאות. לפני תחילת ההליך, להשתמש במספריים כדי להסיר את הקצה של מחט קטטר ולדחוף את הקטטר לחלוטין על קצה המחט. לאחר אישור חוסר תגובה קמצוץ בוהן, להחיל משחה על העיניים של הרדמה, עכבר סינרגטי בן שמונה עד 12 שבועות ולחבר את החותכות העליונות על חוט תפר על פני פלטפורמת צנרור עם החזה בניצב לתפר.
מניחים כבל סיבים אופטיים בין הגפיים הקדמיות כדי להאיר את החזה ולפתוח בזהירות את הפה באמצעות ממטרות שטוחות חיטוי כדי לחלץ את הלשון. חפשו את פליטת האור הלבן כדי לאתר את הגרון, האפיגלוטיס והסחוסים הארטנואידים. לאחר פתיחת קנה הנשימה גלוי בבירור, בעדינות להחליק את הקטטר לתוך קנה הנשימה, עד אבל לא מעבר bifurcation, כדי להבטיח חלוקה שווה של תאי אדנוקרצינומה ריאה בתוך הריאות.
יש לדאוג כי החדרת הקטטר הוא חלק מאוד. אם אתה מרגיש התנגדות כלשהי, להסיר את הקטטר ולחשוף את קנה הנשימה שוב, כדי למנוע פגיעה בעכבר. הסר במהירות את המחט מהקטטר ובדוק אם ניתן לראות את האור הלבן זורח דרך הקטטר.
כדי לאשר מיקום נאות של הקטטר בתוך קנה הנשימה, חבר מזרק מים מיליליטר אחד לקטטר. המים במזרק צריכים לנוע במהירות למעלה ולמטה בזמן עם הנשימה. לפני מסירת ההשעיה התא, לחמם את התאים ביד לטעון 50 microliters של תאים לתוך קטטר.
ברגע ההשעיה הוא שאפתן, לצרף מזרק מיליליטר אחד ריק לקטטר ולחלק 300 microliters של אוויר לתוך הקטטר כדי להבטיח חלוקה מלאה של התאים הגידול בתוך הריאות. לאחר מכן בעדינות להסיר את קטטר ולה מניחים את העכבר על כרית חום עם ניטור עד שליטה מלאה. לאחר נקודת הקצה הניסיונית המתאימה, השרו את הפגר ב-70% אתנול ואבטחו את החיה ללוח ניתוח.
בצע חתך קו האמצע הגחוני בעדינות להפוך את העור כדי לחשוף את שרירי הקיר החזה ואת איברי הבטן. השתמש במספריים כדי לנקב את הסרעפת לחתוך את הצלעות, חשיפת חלל בית החזה. חותכים פתח קטן בחדר השמאלי ולהשתמש מחט מד 27 כדי לבלבל את הריאה שלוש פעמים דרך החדר הימני עם שישה עד שמונה מיליליטר של קרח קר PVS לכל עירוי.
לאחר ההתעלות האחרונה, הריאות צריכות להיות נקיות לחלוטין מדם ולהופיע לבנות. לאחר הקציר, השתמש במספריים כדי לטחון את רקמת הריאה לחתיכות קטנות. מעבירים את שברי הריאה לצינור מיקרוצנטריפוגה שני מיליליטר המכיל 1.5 מיליליטר של חיץ עיכול ריאות עבור דגירה של 30 עד 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, עם רעידות.
בסוף העיכול, להעביר את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 מיקרון לתוך צינור 50 מיליליטר ולהשתמש בקצה של בוכנה סטרילית 10 מיליליטר מזרק ללחוץ על כל שברי רקמה שנותרו דרך המסנן. לשטוף את מסננת עם 15 מיליליטר של PVS, בתוספת 2% FCS. ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה.
להשעות מחדש את גלולה במיליליטר אחד של מאגר אשלגן אמוניום כלורי אשלגן במשך חמש דקות דגירה בטמפרטורת החדר צנטריפוגה התאים שוב. ואז להשעות מחדש את גלולת תא הדם הלבן במיליליטר אחד של PVS בתוספת 2%FCS ולהכתים את התאים לניתוח ציטומטרי זרימה על פי פרוטוקול הניסוי. כצפוי, הישרדותם של העכברים הנמענים מתואמת עם מספר התאים המקוצרים.
והריאות שנקטפו בזמן המוות מדגימות חלוקה שווה של גושים סרטניים בכל האונות. כאשר משווים קטעים מריאות מחסה גידולים אוטוכטוניים, עם גידולים בעקבות תאים סרטניים ריאות מושתלים אורתוטופית, אין הבדלים מורפולוגיים נצפו. ניתוח ציטומטרי זרימה של ביטוי PD-L1 של תאי ריאות מבודדים שלושה שבועות לאחר השתלת תא גידול אורתוטופי לעכברים בעלי יכולת אימונו, כפי שהוכח, חושף ויסות למעלה בביטוי סמן פני השטח של תא PD-L1, בהשוואה לתאי גידול ריאות מתורבתים במבחנה.
לאחר השתלה אורתוטופית, ניתן ליישם שיטות אנליטיות אחרות, כולל ניתוח אימונוהיסטוכימי, ופרופיל mRNA כדי לענות על שאלות ניסיוניות נוספות.
