Fare akciğer adenokarsinom hücrelerinin sinjenik greft alıcılarına ortotopik nakli, fizyolojik koşullar altında tamamen aktif bir bağışıklık sisteminin varlığında tümörigenezin incelenmesine olanak sağlar. Tabii ki, tümörler bir immünyon fareler haline gelişir ve bu çok daha fizyolojik eğer immüneksik farelerde bir nakil yaparsanız. Transplantasyon öncesi tümör hücrelerinin gen düzenlemesi, genetik faktörlerin tümör büyümesi ve gen ekspresyonu profilleri üzerindeki etkisini incelemek için bu modeli doğrudan ve zaman kazandıran bir yaklaşım haline getirir.
İndüklanabilir otokton akciğer tümörü modelleri ile karşılaştırıldığında, Bu yöntem farelerin geniş üreme önler, ve bu nedenle önceki akciğer kanseri fare modellerinin bir arıtma temsil eder. İşleme başlamadan önce, kateter iğnesinin ucunu çıkarmak için makas kullanın ve kateteri iğnenin ucuna tamamen doğru itin. Ayak ucubesine yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, anestezi, sinerjik sekiz ila 12 haftalık farenin gözlerine merhem uygulayın ve üst kesici dişleri entübasyon platformunda dik bir dikme dikliği üzerinde, göğüs sütüne dik bir şekilde bağla.
Göğüs aydınlatmak ve dikkatle dil ayıklamak için dezenfekte düz forceps kullanarak ağız açmak için ön ekstremiteler arasında bir fiber optik kablo yerleştirin. Gırtlak, epiglotve arytenoid kıkırdakları bulmak için beyaz ışık salınımına bakın. Trakeanın açılması açıkça görülebildiğinden, akciğerler içinde akciğer adenokarsinom hücrelerinin eşit dağılımını garanti etmek için kateteri çatallanmanın ötesine kadar ancak daha fazla olmayan bir şekilde trakeaya doğru yavaşça kaydırın.
Kateterin takılmasının çok düzgün olduğuna dikkat edin. Herhangi bir direnç hissediyorsanız, kateteri çıkarın ve farenin yaralanmasını önlemek için nefes borusunu tekrar ortaya çıkarın. İğneyi hızlıca kateterden çıkarın ve beyaz ışığın kateterden parıldadığını kontrol edin.
Kateterin trakeanın içine uygun bir yerleştirilmesini doğrulamak için katetere bir mililitrelik su şırıngası takın. Şırıngadaki su nefes alma ile birlikte zamanda hızla yukarı ve aşağı hareket etmelidir. Hücre süspansiyonu teslim etmeden önce hücreleri elle ısıtın ve 50 mikrolitre hücreyi katetere yükleyin.
Süspansiyon aspire edilir yayınlanmaz, katetere boş bir mililitreşüek ve akciğerler içindeki tümör hücrelerinin tam dağılımını sağlamak için katetere 300 mikrolitre hava dağıtın. Daha sonra kateteri yavaşça çıkarın ve fareyi tam uygun olana kadar izleyerek bir ısı yastığına yerleştirin. Uygun deneysel bitiş noktasından sonra, karkas%70 etanol ıslatın ve bir diseksiyon tahtası için hayvan güvenli.
Bir ventral orta hat kesi yapmak ve yavaşça torasik duvar kasları ve karın organları ortaya çıkarmak için deri ters. Diyafram delmek ve kaburga kesmek için makas kullanın, torasik kavite açığa. Sol ventrikül küçük bir açıklık kesin ve infüzyon başına buz soğuk PVS altı ila sekiz mililitre ile sağ ventrikül ile akciğer üç kez perfüzyon için 27 gauge iğne kullanın.
Son perfüzyondan sonra akciğerler kandan tamamen temiz lenmeli ve beyaz görünmelidir. Hasat tan sonra, küçük parçalar halinde akciğer dokusu kıyma makas kullanın. Akciğer parçalarını, 37 derecede 37 derecede 30 ila 60 dakikalık bir kuluçka için 1,5 mililitre lik akciğer sindirim tamponu içeren iki mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Sindirim sonunda, 50 mililitrelik bir tüp içine 70 mikron hücreli süzgeç aracılığıyla hücre süspansiyon aktarın ve filtre aracılığıyla kalan doku parçaları basın steril 10 mililitrelik şırınga piston sonunda kullanın. Süzgeci 15 mililitre PVS ile durulayınız, %2 FCS ile tamamlayınız. Ve santrifüj ile hücreleri toplamak.
Bir mililitre amonyum klorür potasyum lisis tamponundaki peleti oda sıcaklığında beş dakikalık bir kuluçka için yeniden askıya alın ve hücreleri tekrar santrifüj edin. Daha sonra% 2 FCS ile desteklenen PVS bir mililitre beyaz kan hücresi pelet yeniden askıya ve deneysel protokole göre akış sitometrik analiz için hücreleri leke. Beklendiği gibi, alıcı farelerin hayatta kalma engrafted hücrelerin sayısı ile ilişkilidir.
Ve ölüm sırasında toplanan akciğerler tüm loblarda tümör nodüllerinin eşit dağılımını gösteriyor. Otokton tümör barındıran akciğerlerden alınan kesitler, ortofik transplantasyon akciğer tümör hücrelerini takip eden tümörler ile karşılaştırıldığında morfolojik farklılık gözlenmez. Ortopedik tümör hücre naklinden üç hafta sonra immünyonlu farelere izole edilen akciğer hücrelerinin PD-L1 ekspresyonunun akış sitometrik analizi, az önce gösterildiği gibi, in-vitro kültürlü akciğer tümör hücrelerine kıyasla PD-L1 hücre yüzeyi belirteç ekspresyonunda yukarı regülasyonu ortaya koymaktadır.
Ortotopik transplantasyondan sonra, immünohistokimyasal analiz ve ek deneysel soruları ele almak için mRNA profilleme dahil olmak üzere başka analitik yöntemler uygulanabilir.
