Il trapianto ortotopico di cellule adenocarcinoma polmonari del topo in riceventi di innesto sigeneico consente lo studio della tumorigenesi in presenza di un sistema immunitario pienamente attivo in condizioni fisiologiche. Naturalmente, i tumori si sviluppano in un topo immunocompetibile e questo è molto più fisiologico che se si esegue un trapianto in topi immunodifesa. L'editing genico delle cellule tumorali prima di un trapianto rende questo modello un approccio diretto e che fa risparmiare tempo per studiare l'impatto dei fattori genetici sulla crescita tumorale e sui profili di espressione genica.
Rispetto ai modelli di tumore polmonare autoctono induttibile, questo metodo evita l'allevamento estensivo dei topi e rappresenta quindi un perfezionamento dei precedenti modelli di topo tumorale polmonare. Prima di iniziare la procedura, utilizzare le forbici per rimuovere l'estremità di un ago catetere e spingere completamente il catetere oltre l'estremità dell'ago. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedi, applicare un unguento agli occhi di un topo anestetizzato, sinergico di otto-12 settimane e agganciare gli incisivi superiori su una corda di sutura attraverso una piattaforma di intubazione con il petto perpendicolare alla sutura.
Posizionare un cavo in fibra ottica tra gli arti anteriori per illuminare il petto e aprire con cura la bocca utilizzando forcelle piatte disinfettate per estrarre la lingua. Cerca l'emissione di luce bianca per localizzare la laringe, l'epiglottide e le cartilagine aritenoidi. Una volta che l'apertura della trachea è chiaramente visibile, far scivolare delicatamente il catetere nella trachea, fino alla biforcazione ma non oltre, per garantire una distribuzione uniforme delle cellule adenocarcinoma polmonari all'interno dei polmoni.
Fare attenzione che l'inserimento del catetere sia molto fluido. Se si sente una resistenza, rimuovere il catetere ed esporre nuovamente la trachea per evitare di ferire il mouse. Rimuovere rapidamente l'ago dal catetere e verificare se la luce bianca può essere osservata brillare attraverso il catetere.
Per confermare un corretto posizionamento del catetere all'interno della trachea, attaccare una siringa di un millilitro d'acqua al catetere. L'acqua nella siringa dovrebbe muoversi rapidamente su e giù nel tempo con la respirazione. Prima di fornire la sospensione cellulare, riscaldare le celle a mano e caricare 50 microlitri di cellule nel catetere.
Non appena la sospensione viene aspirata, attaccare una siringa vuota da un millilitro al catetere e erogare 300 microlitri d'aria nel catetere per garantire una distribuzione completa delle cellule tumorali all'interno dei polmoni. Quindi rimuovere delicatamente il catetere e posizionare il mouse su un riscaldatore con monitoraggio fino alla piena rimessenza. Dopo l'endpoint sperimentale appropriato, immergere la carcassa nel 70% di etanolo e fissare l'animale a una scheda di dissezione.
Fai un'incisione ventrale della linea mediana e inverti delicatamente la pelle per esporre i muscoli della parete toracica e gli organi addominali. Utilizzare le forbici per forare il diaframma e tagliare le costole, esponendo la cavità toracica. Tagliare una piccola apertura nel ventricolo sinistro e utilizzare un ago calibro 27 per perfondere il polmone tre volte attraverso il ventricolo destro con da sei a otto millilitri di PVS ghiacciato per infusione.
Dopo l'ultima perfusione, i polmoni dovrebbero essere completamente chiari dal sangue e apparire bianchi. Dopo la raccolta, utilizzare le forbici per tritare il tessuto polmonare in piccoli pezzi. Trasferire i frammenti polmonari in un tubo di microcentrifugo a due millilitri contenente 1,5 millilitri di tampone di digestione polmonare per un'incubazione da 30 a 60 minuti a 37 gradi Celsius, con scuotimento.
Al termine della digestione, trasferire la sospensione cellulare attraverso un colino cellulare da 70 micron in un tubo da 50 millilitri e utilizzare l'estremità di uno stantuffo sterile per siringhe da 10 millilitri per premere eventuali frammenti di tessuto rimanenti attraverso il filtro. Risciacquare il colino con 15 millilitri di PVS, integrato con 2%FCS. E raccogliere le cellule per centrifugazione.
Sospendere nuovamente il pellet in un millilitro di tampone di lisi potassio cloruro di ammonio per un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente e centrifugare nuovamente le cellule. Quindi sospendere nuovamente il pellet di globuli bianchi in un millilitro di PVS integrato con il 2%FCS e macchiare le cellule per l'analisi citometrica del flusso secondo il protocollo sperimentale. Come previsto, la sopravvivenza dei topi ricevente è correlata al numero di cellule innestati.
E i polmoni raccolti al momento della morte dimostrano una distribuzione uniforme dei noduli tumorali in tutti i lobi. Quando si confrontano sezioni di polmoni che ospitano tumori autoctoni, con tumori che seguono cellule tumorali polmonari trapiantate ortotopicamente, non si osservano differenze morfologiche. L'analisi citometrica del flusso dell'espressione PD-L1 delle cellule polmonari isolate tre settimane dopo il trapianto di cellule tumorali ortotopiche in topi immunocompetenti, come appena dimostrato, rivela l'up-regulation nell'espressione del marcatore della superficie cellulare PD-L1, rispetto alle cellule tumorali polmonari coltivate in vitro.
Dopo il trapianto ortotopico, possono essere applicati altri metodi analitici, tra cui l'analisi immunoistochimica e la profilazione dell'mRNA per affrontare ulteriori domande sperimentali.
