La transplantation orthotopique des cellules d’adénocarcinome de poumon de souris dans les destinataires syngeneic de greffe permet l’étude de tumorigenesis en présence d’un système immunitaire entièrement actif dans des conditions physiologiques. Bien sûr, les tumeurs se développent en souris immunocompétence et c’est beaucoup plus physiologique que si vous effectuez une greffe chez des souris immunodéficientes. L’édition génétique des cellules tumorales avant une transplantation fait de ce modèle une approche directe et gain de temps pour étudier l’impact des facteurs génétiques sur la croissance tumorale et les profils d’expression génétique.
Comparée aux modèles autochthonous inducibles de tumeur de poumon, cette méthode évite l’élevage étendu des souris, et représente donc un raffinement des modèles précédents de souris de cancer du poumon. Avant de commencer la procédure, utilisez des ciseaux pour enlever l’extrémité d’une aiguille de cathéter et pousser complètement le cathéter sur l’extrémité de l’aiguille. Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement d’onteil, appliquez l’onguent aux yeux d’une souris anesthésiée et synergétique de huit à 12 semaines et accrochez les incisives supérieures au-dessus d’une corde de suture à travers une plate-forme d’intubation avec la poitrine perpendiculaire à la suture.
Placez un câble à fibre optique entre les membres avant pour éclairer la poitrine et ouvrez soigneusement la bouche à l’aide de forceps plats désinfectés pour extraire la langue. Recherchez l’émission de lumière blanche pour localiser le larynx, l’épiglottis et les cartilages aryténoïdes. Une fois que l’ouverture de la trachée est clairement visible, glissez doucement le cathéter dans la trachée, jusqu’à la bifurcation, mais pas au-delà, pour garantir une distribution uniforme des cellules adénocarcinomes pulmonaires dans les poumons.
Faites en sorte que l’insertion du cathéter soit très lisse. Si vous ressentez une résistance, retirez le cathéter et exposez à nouveau la trachée pour éviter de blesser la souris. Retirez rapidement l’aiguille du cathéter et vérifiez si la lumière blanche peut être observée brillant à travers le cathéter.
Pour confirmer un bon placement du cathéter dans la trachée, fixez une seringue d’eau d’un millilitre au cathéter. L’eau de la seringue doit se déplacer rapidement de haut en bas à temps avec la respiration. Avant de livrer la suspension cellulaire, réchauffer les cellules à la main et charger 50 microlitres de cellules dans le cathéter.
Dès que la suspension est aspirée, fixez une seringue vide d’un millilitre au cathéter et distribuez 300 microlitres d’air dans le cathéter pour assurer une distribution complète des cellules tumorales dans les poumons. Retirez ensuite délicatement le cathéter et placez la souris sur un coussin chauffant avec surveillance jusqu’à ce qu’elle soit complètement couchée. Après le point de terminaison expérimental approprié, tremper la carcasse dans 70% d’éthanol et fixer l’animal à une planche de dissection.
Faire une incision ventrale midline et inverser doucement la peau pour exposer les muscles de la paroi thoracique et les organes abdominaux. Utilisez des ciseaux pour percer le diaphragme et couper les côtes, exposant la cavité thoracique. Couper une petite ouverture dans le ventricule gauche et utiliser une aiguille de calibre 27 pour parcourir le poumon trois fois à travers le ventricule droit avec six à huit millilitres de PVS glacé par perfusion.
Après la dernière perfusion, les poumons doivent être complètement dégagés du sang et apparaître blancs. Après la récolte, utiliser des ciseaux pour émincer le tissu pulmonaire en petits morceaux. Transférer les fragments pulmonaires dans un tube de microcentrifugeuse de deux millilitres contenant 1,5 millilitres de tampon de digestion pulmonaire pendant une incubation de 30 à 60 minutes à 37 degrés Celsius, avec des secousses.
À la fin de la digestion, transférer la suspension cellulaire à l’aide d’une passoire cellulaire de 70 microns dans un tube de 50 millilitres et utiliser l’extrémité d’un piston stérile de seringue de 10 millilitres pour presser les fragments de tissu restants à travers le filtre. Rincer la passoire avec 15 millilitres de PVS, complétées par 2% de FCS. Et recueillir les cellules par centrifugation.
Suspendre à nouveau la pastille dans un millilitre de tampon de lyse de potassium au chlorure d’ammonium pendant une incubation de cinq minutes à température ambiante et centrifuger à nouveau les cellules. Puis re-suspendre la pastille de globules blancs dans un millilitre de PVS complété par 2%FCS et tacher les cellules pour l’analyse cytométrique de flux selon le protocole expérimental. Comme prévu, la survie des souris receveurs est corrélée au nombre de cellules greffées.
Et les poumons récoltés au moment de la mort démontrent une distribution égale des nodules de tumeur dans tous les lobes. En comparant des sections des poumons hébergeant des tumeurs autochthonous, avec des tumeurs suivant les cellules orthotopiques transplantées de tumeur de poumon, aucune différence morphologique n’est observée. L’analyse cytométrique d’écoulement de l’expression de PD-L1 des cellules pulmonaires isolées trois semaines après transplantation orthotopique de cellules de tumeur dans les souris immunocompétentes, comme juste démontré, révèle up-regulation dans l’expression de marqueur de surface cellulaire de PD-L1, comparée aux cellules de tumeur de poumon culturenelle in vitro.
Après la transplantation orthotopique, d’autres méthodes analytiques peuvent être appliquées, y compris l’analyse immunohistochimique, et le profilage de l’ARNm pour répondre à d’autres questions expérimentales.
