O transplante ortotópico de células de adenocarcinoma pulmonar de camundongos em receptores de enxerto sinênico permite o estudo da tumorigênese na presença de um sistema imunológico totalmente ativo sob condições fisiológicas. Claro, os tumores se desenvolvem em camundongos de imunocompetência e isso é muito mais fisiológico que se você realizar um transplante em camundongos imunodeficientes. A edição de genes das células tumorais antes de um transplante torna esse modelo uma abordagem direta e de economia de tempo para estudar o impacto de fatores genéticos no crescimento do tumor e nos perfis de expressão genética.
Comparado aos modelos de tumores pulmonares autóctones induíveis, este método evita a reprodução extensiva de camundongos e, portanto, representa um refinamento de modelos anteriores de camundongos com câncer de pulmão. Antes de iniciar o procedimento, use uma tesoura para remover a extremidade de uma agulha de cateter e empurre o cateter completamente sobre a extremidade da agulha. Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé, aplique pomada aos olhos de um rato anestesizado e sinérgico de oito a 12 semanas de idade e gancho os incisivos superiores sobre uma corda de sutura em uma plataforma de intubação com o peito perpendicular à sutura.
Coloque um cabo de fibra óptica entre os membros da frente para iluminar o peito e abra cuidadosamente a boca usando fórceps planos desinfetados para extrair a língua. Procure a emissão de luz branca para localizar a laringe, epiglote e cartilagens aritóides. Uma vez que a abertura da traqueia é claramente visível, deslize suavemente o cateter para dentro da traqueia, até, mas não além da bifurcação, para garantir uma distribuição uniforme das células de adenocarcinoma pulmonar dentro dos pulmões.
Tome cuidado para que a inserção do cateter seja muito lisa. Se sentir alguma resistência, remova o cateter e exponha a traqueia novamente para evitar ferir o rato. Remova rapidamente a agulha do cateter e verifique se a luz branca pode ser observada brilhando através do cateter.
Para confirmar uma colocação adequada do cateter dentro da traqueia, conecte uma seringa de um mililitro de água ao cateter. A água da seringa deve mover-se rapidamente para cima e para baixo no tempo com a respiração. Antes de entregar a suspensão celular, aqueça as células manualmente e carregue 50 microliters de células no cateter.
Assim que a suspensão for aspirada, conecte uma seringa vazia de um mililitro ao cateter e distribua 300 microliters de ar no cateter para garantir uma distribuição completa das células tumorais dentro dos pulmões. Em seguida, retire suavemente o cateter e coloque o mouse em uma almofada de calor com monitoramento até a recumedência total. Após o ponto final experimental apropriado, mergulhe a carcaça em 70% de etanol e segure o animal em uma placa de dissecção.
Faça uma incisão de linha média ventral e inverta suavemente a pele para expor os músculos torácicos da parede e os órgãos abdominais. Use uma tesoura para perfurar o diafragma e cortar as costelas, expondo a cavidade torácica. Corte uma pequena abertura no ventrículo esquerdo e use uma agulha de calibre 27 para perfumar o pulmão três vezes através do ventrículo direito com seis a oito mililitros de PVS frios por infusão.
Após a última perfusão, os pulmões devem estar completamente livres de sangue e parecem brancos. Após a colheita, use uma tesoura para picar o tecido pulmonar em pequenos pedaços. Transfira os fragmentos pulmonares em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros contendo 1,5 mililitros de tampão de digestão pulmonar para uma incubação de 30 a 60 minutos a 37 graus Celsius, com agitação.
No final da digestão, transfira a suspensão celular através de um coador de células de 70 mícrons em um tubo de 50 mililitros e use a extremidade de um estéril êinge de 10 mililitros para pressionar quaisquer fragmentos de tecido restantes através do filtro. Enxágüe o coador com 15 mililitros de PVS, complementado com 2%de FCS. E coletar as células por centrifugação.
Suspenda novamente a pelota em um mililitro de tampão de potássio de cloreto de amônio para uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente e centrifugar as células novamente. Em seguida, suspenda novamente a pelota de glóbulos brancos em um mililitro de PVS suplementado com 2% de FCS e manche as células para análise citométrica de fluxo de acordo com o protocolo experimental. Como esperado, a sobrevivência dos camundongos receptores está correlacionada com o número de células engrafadas.
E os pulmões colhidos na hora da morte demonstram uma distribuição uniforme de nódulos tumorais em todos os lóbulos. Ao comparar seções de pulmões que abrigam tumores autóctones, com tumores seguindo células tumorais pulmonares ortotopicamente transplantadas, não são observadas diferenças morfológicas. A análise citométrica de fluxo da expressão PD-L1 de células pulmonares isoladas três semanas após o transplante de células tumorais ortotópicas em camundongos imunocompetuntes, como apenas demonstrado, revela a regulação na expressão do marcador de superfície da célula PD-L1, em comparação com células tumorais in vitro cultivadas.
Após o transplante ortotópico, outros métodos analíticos podem ser aplicados, incluindo análise imunohistoquímica e perfil de mRNA para abordar questões experimentais adicionais.
