El trasplante ortotópico de células de adenocarcinoma pulmonar de ratón en receptores de injertos singéneos permite el estudio de la tumorigenesis en presencia de un sistema inmunitario completamente activo en condiciones fisiológicas. Por supuesto, los tumores se convierten en ratones de inmunocompetencia y esto es mucho más fisiológico que si realizas un trasplante en ratones inmunodeficientes. La edición génica de las células tumorales antes de un trasplante hace de este modelo un enfoque directo y que ahorra tiempo para estudiar el impacto de los factores genéticos en el crecimiento tumoral y los perfiles de expresión génica.
En comparación con los modelos de tumores pulmonares autóctonos inducibles, este método evita la cría extensiva de ratones, y por lo tanto representa un refinamiento de los modelos anteriores de ratón de cáncer de pulmón. Antes de comenzar el procedimiento, utilice tijeras para extraer el extremo de una aguja de catéter y empuje el catéter completamente sobre el extremo de la aguja. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco de los dedos de los dedos, aplique un ung ón en los ojos de un ratón anestesado y sinérgico de ocho a 12 semanas de edad y enganche los incisivos superiores sobre una cadena de sutura a través de una plataforma de intubación con el pecho perpendicular a la sutura.
Coloque un cable de fibra óptica entre las extremidades delanteras para iluminar el pecho y abra cuidadosamente la boca utilizando fórceps planos desinfectados para extraer la lengua. Busque la emisión de luz blanca para localizar la laringe, la epiglotis y los cartílagos arytenoides. Una vez que la apertura de la tráquea es claramente visible, deslice suavemente el catéter en la tráquea, hasta pero no más allá de la bifurcación, para garantizar una distribución uniforme de las células pulmonares del adenocarcinoma dentro de los pulmones.
Tenga cuidado de que la inserción del catéter sea muy suave. Si siente alguna resistencia, retire el catéter y exponga la tráquea de nuevo para evitar dañar al ratón. Retire rápidamente la aguja del catéter y compruebe si se puede observar la luz blanca que brilla a través del catéter.
Para confirmar una colocación adecuada del catéter dentro de la tráquea, adjunte una jeringa de agua de un mililitro al catéter. El agua de la jeringa debe moverse rápidamente hacia arriba y hacia abajo a tiempo con la respiración. Antes de suministrar la suspensión celular, caliente las células a mano y cargue 50 microlitros de células en el catéter.
Tan pronto como se aspire la suspensión, adjunte una jeringa vacía de un mililitro al catéter y dispensar 300 microlitros de aire en el catéter para garantizar una distribución completa de las células tumorales dentro de los pulmones. A continuación, retire suavemente el catéter y coloque el ratón sobre una almohadilla de calor con supervisión hasta que se vuelva a colocar completamente. Después del punto final experimental apropiado, remoje la carcasa en 70% etanol y fije el animal a una mesa de disección.
Haga una incisión ventral de la línea media e invierta suavemente la piel para exponer los músculos de la pared torácica y los órganos abdominales. Usa tijeras para perforar el diafragma y cortar las costillas, exponiendo la cavidad torácica. Cortar una pequeña abertura en el ventrículo izquierdo y utilizar una aguja de calibre 27 para perfunder el pulmón tres veces a través del ventrículo derecho con seis a ocho mililitros de PVS frío por perfusión.
Después de la última perfusión, los pulmones deben estar completamente limpios de sangre y aparecer blancos. Después de la cosecha, utilice tijeras para picar el tejido pulmonar en trozos pequeños. Transfiera los fragmentos pulmonares a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros que contenga 1,5 mililitros de tampón de digestión pulmonar para una incubación de 30 a 60 minutos a 37 grados centígrados, con temblores.
Al final de la digestión, transfiera la suspensión celular a través de un colador celular de 70 micras a un tubo de 50 mililitros y utilice el extremo de un émbolo estéril de jeringa de 10 mililitros para presionar los fragmentos de tejido restantes a través del filtro. Enjuagar el colador con 15 mililitros de PVS, complementado con 2%FCS. Y recoger las células por centrifugación.
Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tópido de nilicesis de potasio de cloruro de amonio para una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente y centrifugar las células de nuevo. Luego vuelva a suspender el gránulo de glóbulos blancos en un mililitro de PVS complementado con 2%FCS y manche las células para el análisis citométrico de flujo de acuerdo con el protocolo experimental. Como era de esperar, la supervivencia de los ratones receptores se correlaciona con el número de células injertadas.
Y los pulmones cosechados en el momento de la muerte demuestran una distribución uniforme de los nódulos tumorales a lo largo de todos los lóbulos. Al comparar secciones de pulmones que albergan tumores autóctonos, con tumores después de células tumorales pulmonares trasplantadas ortotópicamente, no se observan diferencias morfológicas. El análisis citométrico de flujo de la expresión PD-L1 de células pulmonares aisladas tres semanas después del trasplante ortotópico de células tumorales en ratones inmunocompetentes, como acaba de demostrar, revela una regulación superior en la expresión de marcadores de superficie celular PD-L1, en comparación con las células tumorales pulmonares cultivadas in vitro.
Después del trasplante ortotópico, se pueden aplicar otros métodos analíticos, incluido el análisis inmunohistoquímico, y el perfilado de ARNm para abordar preguntas experimentales adicionales.
