Die orthotopische Transplantation von Mauslungen-Adenokarzinomzellen in syngene Transplantatempfänger ermöglicht die Untersuchung der Tumorgenese in Gegenwart eines vollaktiven Immunsystems unter physiologischen Bedingungen. Natürlich entwickeln sich die Tumoren zu einer Immunkompetenz-Mäuse und dies ist viel physiologischer, dass, wenn Sie eine Transplantation bei immundefizienten Mäusen durchführen. Die Genbearbeitung der Tumorzellen vor einer Transplantation macht dieses Modell zu einem direkten und zeitsparenden Ansatz, um die Auswirkungen genetischer Faktoren auf das Tumorwachstum und die Genexpressionsprofile zu untersuchen.
Im Vergleich zu induzierbaren autochthonen Lungentumormodellen vermeidet diese Methode die extensive Züchtung von Mäusen und stellt somit eine Verfeinerung früherer Lungenkrebs-Mausmodelle dar. Vor Beginn des Eingriffs verwenden Sie eine Schere, um das Ende einer Katheternadel zu entfernen und den Katheter vollständig über das Ende der Nadel zu drücken. Nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifen, tragen Salbe auf die Augen einer anästhesierten, synergetischen acht bis 12 Wochen alten Maus auf und haken die oberen Schneidezähne über eine Nahtschnur über eine Intubationsplattform mit der Brust senkrecht zur Naht.
Legen Sie ein Glasfaserkabel zwischen die vorderen Gliedmaßen, um die Brust zu beleuchten und öffnen Sie vorsichtig den Mund mit desinfizierten flachen Zangen, um die Zunge zu extrahieren. Achten Sie auf die Emission von weißem Licht, um den Kehlkopf, Epiglottis und Arytenoid Knorpel zu lokalisieren. Sobald die Öffnung der Luftröhre deutlich sichtbar ist, schieben Sie den Katheter vorsichtig in die Luftröhre, bis zur Bifurkation, aber nicht über die Bifurkation hinaus, um eine gleichmäßige Verteilung der Lungenadenokarzinomzellen innerhalb der Lunge zu gewährleisten.
Achten Sie darauf, dass das Einführen des Katheters sehr glatt ist. Wenn Sie Widerstand spüren, entfernen Sie den Katheter und setzen Sie die Luftröhre wieder aus, um eine Verletzung der Maus zu vermeiden. Entfernen Sie schnell die Nadel aus dem Katheter und prüfen Sie, ob das weiße Licht durch den Katheter leuchtend beobachtet werden kann.
Um eine ordnungsgemäße Platzierung des Katheters innerhalb der Luftröhre zu bestätigen, befestigen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze Wasser am Katheter. Das Wasser in der Spritze sollte sich mit der Atmung schnell nach oben und unten bewegen. Bevor Sie die Zellsuspension abgeben, erwärmen Sie die Zellen von Hand und laden Sie 50 Mikroliter Zellen in den Katheter.
Sobald die Suspension angesaugt ist, befestigen Sie eine leere Ein-Milliliter-Spritze am Katheter und geben Sie 300 Mikroliter Luft in den Katheter, um eine vollständige Verteilung der Tumorzellen innerhalb der Lunge zu gewährleisten. Entfernen Sie dann vorsichtig den Katheter und legen Sie die Maus auf ein Heatpad mit Überwachung bis zur vollen Recumbency. Nach dem entsprechenden experimentellen Endpunkt den Kadaver in 70% Ethanol einweichen und das Tier an einer Sezierplatte feststellen.
Machen Sie einen ventralen Mittellinienschnitt und kehren Sie die Haut sanft um, um die Brustwandmuskulatur und die Bauchorgane freizulegen. Verwenden Sie eine Schere, um das Zwerchfell zu durchstechen und die Rippen zu schneiden, wodurch die Brusthöhle freigelegt wird. Schneiden Sie eine kleine Öffnung in den linken Ventrikel und verwenden Sie eine 27 Gauge Nadel, um die Lunge dreimal durch den rechten Ventrikel mit sechs bis acht Millilitere eiskalte PVS pro Infusion zu durchdringen.
Nach der letzten Perfusion sollte die Lunge vollständig blutfrei sein und weiß erscheinen. Nach der Ernte verwenden Sie eine Schere, um das Lungengewebe in kleine Stücke zu zerkleinern. Übertragen Sie die Lungenfragmente in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr mit 1,5 Milliliter Lungenverdauungspuffer für eine Inkubation von 30 bis 60 Minuten bei 37 Grad Celsius, mit Schütteln.
Übertragen Sie am Ende der Verdauung die Zellsuspension durch ein 70-Mikron-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Rohr und verwenden Sie das Ende eines sterilen 10-Milliliter Spritzenkolbens, um alle verbleibenden Gewebefragmente durch den Filter zu pressen. Spülen Sie das Sieb mit 15 Milliliter PVS, ergänzt durch 2%FCS. Und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.
Das Pellet in einem Milliliter Ammoniumchlorid-Kaliumlysepuffer für eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur wieder aufhängen und die Zellen wieder zentrieren. Dann setzen Sie das weiße Blutkörperchen Pellet in einem Milliliter PVS mit 2%FCS ergänzt und färben die Zellen für die Strömung zytometrische Analyse nach dem experimentellen Protokoll. Wie erwartet wird das Überleben der Empfängermäuse mit der Anzahl der transplantierten Zellen korreliert.
Und die Zum Zeitpunkt des Todes geerntete Lunge zeigt eine gleichmäßige Verteilung von Tumorknollen in allen Lappen. Beim Vergleich von Abschnitten aus der Lunge, die autochthone Tumoren beherbergen, mit Tumoren, die orthototisch transplantierten Lungentumorzellen folgen, werden keine morphologischen Unterschiede beobachtet. Die zytometrische Analyse der PD-L1-Expression von Lungenzellen, die drei Wochen nach der orthotopischen Tumorzelltransplantation in immunkompetente Mäuse isoliert wurde, zeigt, wie gerade gezeigt, eine Up-Regulation in der PD-L1-Zell-Oberflächenmarker-Expression im Vergleich zu in-vitro-kultivierten Lungentumorzellen.
Nach der orthotopischen Transplantation können andere analyseanalytische Methoden angewendet werden, einschließlich immunhistochemischer Analysen und mRNA-Profiling, um zusätzliche experimentelle Fragen zu beantworten.
