השיטה בה אנו משתמשים כאן יכולה לעזור לארוז אוליגונוקלאוטיד עם ננו-צינורית פחמן חד-קירית, שהיא סוג חדש של חלקיקים לאספקת תרופות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא אספקה יעילה יותר של תרופות oligonucleotide לתאים ב vivo. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לחקור מיאלומה נפוצה, כי זה הציג חלקיקים כדי לשפר את המסירה של תרופות oligonucleotide.
באמצעות שיטה זו יכול לספק תובנה לתוך הטיפול מיאלומה נפוצה. זה יכול להיות מיושם גם על מחלות אחרות, נדנוד עם מטען אחר, כגון חלבונים ומולקולות קטנות. ראשית, מערבבים מיליגרם אחד של צינוריות פחמן חד-קיר, חמישה מיליגרם של DSPE-PEG 2000 אמין, וחמישה מיליליטר של מים מעוקרים ללא גרעין בבקבוקון זכוכית 20 מיליליטר.
Sonicate הבקבוקון ב sonicator מרבה מים ברמת כוח של 90 וואט במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר sonication, צנטריפוגה הבקבוקון ב 24, 000 פעמים g במשך שש שעות. ואז לאסוף את הפתרון על טבעי.
הוסף מיליליטר אחד של פתרון ננו-צינורית פחמן חד-קיר למכשיר סינון צנטריפוגלי צנטריפוגלי של 100 קילודלטון ואחריו ארבעה מיליליטר של מים מעוקרים ללא גרעין. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 4, 000 פעמים גרם בטמפרטורת החדר כדי להסיר את המין העודף. הוסף 0.5 מיליגרם של Sulfo-LC-SPDP ל 450 microliters של ננו-צינורית פחמן חד-קיר פונקציונלי אמין.
לאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטרים של 10x PBS, והדקירה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מוסיפים את תערובת התגובה למכשיר מסנן צנטריפוגלי כתוצאה מחיתוך משקל מולקולרי של 100 קילודלטון, ואחריו ארבעה מיליליטר של מים נטולי גרעין. צנטריפוגה המדגם במשך 10 דקות ב 4, 000 פעמים גרם בטמפרטורת החדר כדי להסיר את עודף Sulfo-LC-SPDP.
לאסוף את Sulfo-LC-SPDP-מטופלים אמין חד קיר פחמן nanotube פתרון נשאר במסנן, ולדלל אותו עם 500 microliters של פתרון אנטי MALAT1-Cy3 שהוכן בעבר. ואז להדגים את המדגם בארבע מעלות צלזיוס לילה. כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר של השוואה, סדר באופן אקראי 14 עכברים לקבוצות ניסוי או בקרה עם שבעה בכל קבוצה, ועם יחס זכר-לנקבה זהה בכל קבוצה.
לאחר מכן, נקו את ספסל הניתוח וערקו אותו ב-70% אלכוהול אתיל. השתמש במנורת חימום כדי לחמם את אחד העכברים כדי לעזור לווריד הזנב להופיע. לרסן את העכבר כראוי עם מרסן הזרקת זנב.
הזרקת MM.1S-luc/mCherry תאים ב 50 microliters של PBS דרך וריד הזנב. לחץ על אתר ההזרקה עם ספוגית אלכוהול במשך 30 שניות. לאחר מכן סמן את העכבר המוזרק והחזר אותו לכלוב נקי.
ביום השביעי, לאחר הזרקת תא MM1S, להזריק 50 microliters של PBS המכיל ננו-צינור פחמן חד קיר אנטי MALAT1 לתוך וריד הזנב של העכבר. לאחר מכן לחץ על אתר ההזרקה עם ספוגית אלכוהול במשך 30 שניות. שימו לב לדימום המקומי על הזנב ולהתנהגות הכללית של העכבר למשך דקה אחת, ואז החזירו אותו לכלוב נקי.
שימו לב שוב לכל העכברים המוזרקים לפני החזרת הכלוב למדף כדי לוודא שהזריקות נסבלות היטב. לשקול כל עכבר לפני הניתוח. לאסוף דם היקפי מהלב עבור בדיקת ספירת דם מלאה שבוצעה על ידי מכונת מונה תאי דם.
לאחר מכן, לאסוף את הרקמות של מח העצם, הטחול, בלוטות הלימפה, הכליה, ואת הרקמה עם גרורות גלוי. יש לחלץ RNA וחלבון מדגימות מח העצם. לתקן את כל הרקמות הנותרות בפורמלין.
לאחר 24 שעות של קיבעון, לטבול את דגימות העצם בתתברית EDTA 0.5-טוחן במשך חמישה ימים עבור decalcification. לאחר מכן לטבול את כל הדגימות ב 75% אתיל אלכוהול לאחסון לטווח ארוך. תוצאות ה-QRT PCR הראו כי דנ"א נגד MALAT1 gapmeR הפיל את הביטוי MALAT1 וגרם לאפופטוזיס באופן משמעותי בתאי H929 ו- MM.1S.
פחמן חד-קיר ננו-צינורית נגד MALAT1-Cy3 נמסר לתוך הגרעין של תאי MM, והדחיק באופן משמעותי את רמת MALAT1 אנדוגני הן בתאי H929 ו MM.1S. הכדאיות של תא BMEC-1 אין הבדל משמעותי לאחר טיפול של צינור פחמן חד קיר אנטי MALAT1-Cy3 או שליטה במינונים שונים ונקודות זמן. זה מציין כי הרעילות של פחמן חד קיר ננו-צינורית אנטי MALAT1-Cy3 יש רעילות מוגבלת ומקובלת לתאים נורמליים במינון גבוה.
מודל עכבר אנושי המופץ על ידי MM הוקם כדי להעריך את השפעות הטיפול של פחמן חד קיר nanotube אנטי MALAT1 ב vivo. אותות לוציפרון של עכברים בקבוצת הטיפול נגד MALAT1 פחמן חד קיר היו נמוכים להפליא בהשוואה לשליטה לאחר 21 ימים של טיפול. מתוצאות אלה, הגיע למסקנה כי טיפול ננו-צינור פחמן חד-קיר נגד MALAT1 באמצעות הזרקה תוך וררית יכול לספק את האוליגוס נגד MALAT1 לתאי הגידול ביעילות.
לא נצפו תופעות לוואי משמעותיות של הטיפול, מה שמצביע על כך שהזרקת ננו-צינורית פחמן חד-קירית נגד MALAT1 היא טיפול בטוח לעכברים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי הרכב מולקולת התא ישפיע על המסירה, היעילות, ואת ההשפעה הטיפולית של תרופות oligonucleotide. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו תיוג חלבונים או מולקולות קטנות על מנת לענות על שאלות נוספות.
כמו להשתמש בננו-צינוריות פחמן חד-קיר כדי לספק תרופות אחרות.
