O método que estamos usando aqui pode ajudar a embalar oligonucleotídeo com nanotubo de carbono de parede única, que é um novo tipo de nanopartícula para entrega de drogas. A principal vantagem dessa técnica é a entrega mais eficiente de medicamentos oligonucleotídeos em células in vivo. As implicações desta técnica se estendem à pesquisa de mieloma múltiplo, porque introduziu nanopartículas para melhorar a entrega de medicamentos oligonucleotídeos.
Através deste método pode fornecer insights sobre o tratamento para mieloma múltiplo. Também pode ser aplicado a outras doenças e conjugado com outras cargas, como proteínas e pequenas moléculas. Primeiro, misture um miligrama de nanotubos de carbono de parede única, cinco miligramas de DSPE-PEG 2000 amina, e cinco mililitros de água esterilizada sem nuclease em um frasco de cintilação de vidro de 20 mililitros.
Sonicar o frasco em um sonicator de banho d'água a um nível de potência de 90 watts por uma hora em temperatura ambiente. Após a sônicação, centrifugar o frasco a 24.000 vezes g durante seis horas. Então colete a solução sobrenante.
Adicione um mililitro da solução de nanotubo de carbono de parede única a um dispositivo de filtro centrífugo de corte de peso molecular de 100 quilodalton, seguido por quatro mililitros de água esterilizada sem nuclease. Centrifugar por 10 minutos a 4.000 vezes g à temperatura ambiente para remover o excesso de amina. Adicione 0,5 miligramas de Sulfo-LC-SPDP a 450 microliters do nanotubo de carbono de parede única funcionalizado amina.
Em seguida, adicione 50 microliters de 10x PBS, e incubar por duas horas em temperatura ambiente. Em seguida, adicione a mistura de reação a um dispositivo de filtro centrífugo de corte de peso molecular de 100 quilodalton, seguido por quatro mililitros de água sem nuclease. Centrifugar a amostra por 10 minutos a 4.000 vezes g à temperatura ambiente para remover o excesso de Sulfo-LC-SPDP.
Colete a solução de nanotubo de carbono de uma parede única tratada pelo Sulfo-LC-SPDP deixada no filtro e dilua-a com 500 microliters de solução anti-MALAT1-Cy3 previamente preparada. Em seguida, incubar a amostra a quatro graus Celsius durante a noite. Para alcançar os melhores resultados de comparação, organize aleatoriamente 14 ratos em grupos de ensaio ou controle com sete em cada grupo, e com a mesma proporção homem-mulher em cada grupo.
Em seguida, limpe o banco de operação e esterilize-o com 70% de álcool etílico. Use uma lâmpada de aquecimento para aquecer um dos ratos para ajudar a veia da cauda a aparecer. Contenha o mouse corretamente com um conterrático de injeção de cauda.
Injete células MM.1S-luc/mCherry em 50 microliters de PBS através da veia traseira. Pressione o local da injeção com um cotonete de álcool por 30 segundos. Em seguida, marque o rato injetado e devolva-o para uma gaiola limpa.
No sétimo dia, após a injeção de células MM1S, injete 50 microliters de PBS contendo nanotubo de carbono de parede única anti-MALAT1 na veia traseira do mouse. Em seguida, pressione o local da injeção com um cotonete de álcool por 30 segundos. Observe o sangramento local na cauda e o comportamento geral do rato por um minuto e, em seguida, devolva-o para uma gaiola limpa.
Observe todos os camundongos injetados novamente antes de retornar a gaiola para o rack para garantir que as injeções sejam toleradas bem. Pesar cada rato antes da dissecação. Colete sangue periférico do coração para um ensaio completo de contagem sanguínea realizado por uma máquina de contador de células sanguíneas.
Em seguida, recolham os tecidos da medula óssea, baço, linfonodo, rim e tecido com metástase visível. Extrair RNA e proteína das amostras de medula óssea. Conserte todos os tecidos restantes em formalina.
Após 24 horas de fixação, mergulhe as amostras ósseas em uma solução EDTA 0,5 molar por cinco dias para descalcificação. Em seguida, mergulhe todas as amostras em 75% de álcool etílico para armazenamento a longo prazo. Os resultados do QRT PCR mostraram que o DNA de gapmer anti-MALAT1 derrubou a expressão MALAT1 e induziu significativamente a apoptose nas células H929 e MM.1S.
Nanotubo de carbono de parede única anti-MALAT1-Cy3 foi entregue no núcleo das células MM, e suprimiu significativamente o nível de MALAT1 endógeno em ambas as células H929 e MM.1S. A viabilidade da célula BMEC-1 não tem diferença significativa após o tratamento do nanotubo de carbono de parede única anti-MALAT1-Cy3 ou controle em diferentes dosagens e pontos de tempo. Isso indica que a toxicidade do nanotubo de carbono de parede única anti-MALAT1-Cy3 tem uma toxicidade limitada e aceitável para células normais em alta dosagem.
Um modelo de camundongos disseminado por MM humano foi criado para avaliar os efeitos de tratamento do nanotubo de carbono de parede única anti-MALAT1 in vivo. Os sinais de luciferon de camundongos no grupo de tratamento anti-MALAT1 de nanotubo de carbono de parede única foram notavelmente menores em comparação com o controle após 21 dias de tratamento. A partir desses resultados, concluiu-se que o tratamento anti-MALAT1 de nanotubo de carbono de parede única através de injeção intravenosa poderia fornecer os oligos anti-MALAT1 para as células tumorais efetivamente.
Não foram observados efeitos colaterais significativos do tratamento, indicando que a injeção anti-MALAT1 de nanotubo de carbono de parede única é um tratamento seguro para camundongos. Ao tentar esse procedimento, é importante lembrar que a composição da molécula celular influenciará a entrega, eficiência e efeito terapêutico dos medicamentos oligonucleotídeos. Após esse procedimento, outros métodos como a conjugação de proteínas ou pequenas moléculas podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais.
Como usar nanotubos de carbono de parede única para entregar outras drogas.
