ここで使用している方法は、薬物送達のための新しいタイプのナノ粒子である単層カーボンナノチューブでオリゴヌクレオチドをパッケージ化するのに役立ちます。この技術の主な利点は、生体内の細胞へのオリゴヌクレオチド薬物のより効率的な送達である。この技術の意味は、オリゴヌクレオチド薬の送達を改善するためにナノ粒子を導入しているため、多発性骨髄腫の研究にも及ぶ。
この方法を通して多発性骨髄腫の治療に関する洞察を提供できる。また、他の疾患に適用され、タンパク質や小分子などの他の貨物と共役することができます。まず、1ミリグラムの単層カーボンナノチューブ、DSPE-PEG 2000アミン5ミリグラム、滅菌ヌクレアーゼフリー水5ミリリットルを20ミリリットルガラスシンチレーションバイアルに混ぜます。
室温で1時間90ワットの電力レベルで水浴ソニケーターでバイアルを超音波処理します。超音波処理に続いて、6時間24,000回gでバイアルを遠心分離します。その後、上清溶液を収集します。
100キロダルトンの分子量カットオフ遠心フィルター装置に単層カーボンナノチューブ溶液の1ミリリットルを加え、続いて殺菌されたヌクレアーゼを含まない水を4ミリリットル加えます。遠心分離機は室温で4,000倍gで10分間、過剰なアミンを除去した。アミン機能化された単層カーボンナノチューブの450マイクロリットルにスルフォ-LC-SPDPの0.5ミリグラムを加えます。
その後、50マイクロリットルの10倍PBSを加え、室温で2時間インキュベートします。次に、反応混合物を100キロダルトン分子量カットオフ遠心フィルター装置に加え、続いて4ミリリットルのヌクレアーゼを含まない水を加える。試料を室温で4,000回gで10分間遠心し、過剰なスルホン-LC-SPDPを除去する。
フィルターに残されたSulfo-LC-SPDP処理アミン単層カーボンナノチューブ溶液を回収し、以前に調製した抗MALAT1-Cy3溶液を500マイクロリットルで希釈します。その後、一晩摂氏4度でサンプルをインキュベートします。比較の最良の結果を達成するために、各グループに7匹、各群で同じ男女比を持つ試験または対照群に14匹のマウスを無作為に配置する。
次に、手術台を清掃し、70%エチルアルコールで殺菌します。加熱ランプを使用して、尾静脈が現れるのを助けるためにマウスの1つを温めます。尾部注入の抑制剤でマウスを正しく拘束してください。
尾静脈を通して50マイクロリットルのPBSでMM.1S-luc/mCherry細胞を注入する。アルコール綿棒で注射部位を30秒間押します。次に、注射されたマウスにマークを付け、クリーンケージに戻します。
7日目、MM1S細胞注射後、マウスの尾静脈に単一壁カーボンナノチューブ抗MALAT1を含むPBSの50マイクロリットルを注入する。その後、アルコール綿棒で注射部位を30秒間押します。尾の局所出血とマウスの一般的な挙動を1分間観察し、清潔なケージに戻します。
ケージをラックに戻す前に、注射されたすべてのマウスを再び観察して、注射が十分に許容されることを確認します。解剖前に各マウスの重量を量る。心臓から末梢血を採取し、血液細胞カウンター装置によって行われる完全な血数アッセイを行う。
次に、骨髄、脾臓、リンパ節、腎臓、および目に見える転移を有する組織の組織を採取する。骨髄サンプルからRNAとタンパク質を抽出します。ホルマリンの残りの組織をすべて修正します。
24時間の固定後、骨サンプルを0.5モルEDTA溶液に5日間浸漬して脱灰します。その後、すべてのサンプルを75%エチルアルコールに浸して長期保存します。QRT PCRの結果は、抗MALAT1ギャップメRDNAがMALAT1発現をノックダウンし、H929およびMM.1S細胞で有意にアポトーシスを誘発したことを示した。
単層カーボンナノチューブ抗MALAT1-Cy3をMM細胞の核に送達し、H929およびMM.1S細胞の両方で内因性MALAT1レベルを有意に抑制した。BMEC-1細胞の生存率は、単層カーボンナノチューブ抗MALAT1-Cy3の処理後、または異なる用量およびタイムポイントでの制御後に有意な差はない。これは、単層カーボンナノチューブ抗MALAT1-Cy3の毒性が、高用量で正常細胞に対して限定的かつ許容可能な毒性を有することを示している。
ヒトMM播種マウスモデルを確立し、生体内における単層カーボンナノチューブ反MALAT1の治療効果を評価した。単層カーボンナノチューブ抗MALAT1治療群におけるマウスのルシフェロンシグナルは、21日間の治療後の対照と比較して著しく低かった。これらの結果から、静脈注射による単層カーボンナノチューブ抗MALAT1治療は、抗MALAT1オリゴを腫瘍細胞に効果的に送達できると結論付けた。
治療の有意な副作用は認められず、単層カーボンナノチューブ抗MALAT1注射がマウスにとって安全な治療法であることを示す。この手順を試みる間、細胞分子組成物はオリゴヌクレオチド薬の送達、効率、および治療効果に影響を与えることを覚えておくことが重要である。この手順に従って、タンパク質または小分子の結合のような他の方法は、追加の質問に答えるために行うことができる。
他の薬を提供するために単一壁カーボンナノチューブを使用するように。
