Метод, который мы используем здесь, может помочь упаковать олигонуклеотид с одностенной углеродной нанотрубкой, которая является новым типом наночастиц для доставки лекарств. Основным преимуществом этого метода является более эффективная доставка олигонуклеотидных препаратов в клетки in vivo. Последствия этого метода распространяются на исследования множественной миеломы, потому что она введена наночастицы для улучшения доставки олигонуклеотидных препаратов.
С помощью этого метода может обеспечить понимание лечения множественной миеломы. Он также может быть применен к другим заболеваниям и спрягаться с другими грузами, такими как белки и мелкие молекулы. Во-первых, смешать один миллиграмм одностенных углеродных нанотрубок, пять миллиграммов амина DSPE-PEG 2000 и пять миллилитров стерилизованной нуклеазной воды в 20-миллилитровом стеклянном сцинтилляционном флаконе.
Sonicate флакон в водяной бане sonicator на уровне мощности 90 Вт в течение одного часа при комнатной температуре. После соникации центрифугают флакон в 24 000 раз г в течение шести часов. Затем соберите супернатантное решение.
Добавьте один миллилитр одностенного раствора углеродных нанотрубок в 100-килодальтонное молекулярное устройство для центробежного фильтра отсечения, за которым последуют четыре миллилитров стерилизованной воды без нуклеазы. Центрифуга в течение 10 минут при 4000 раз г при комнатной температуре, чтобы удалить избыток амина. Добавьте 0,5 миллиграмма Sulfo-LC-SPDP к 450 микролитров нанотрубки углерода, функционализированной из амина.
Затем добавьте 50 микролитров 10x PBS и инкубировать в течение двух часов при комнатной температуре. Затем добавьте реакционной смеси в 100-килодальтонный молекулярный вес устройства центробежного фильтра, за которым последуют четыре миллилитров воды без нуклеазы. Центрифуга образца в течение 10 минут при температуре 4 000 г при комнатной температуре, чтобы удалить избыток Сульфо-LC-SPDP.
Соберите обработанный Сульфо-LC-SPDP раствор амина из углерода, оставленный в фильтре, и разбавьте его 500 микролитров ранее подготовленного раствора анти-МАЛАТ1-Cy3. Затем инкубировать образец при четырех градусах по Цельсию в одночасье. Для достижения наилучших результатов сравнения, случайным образом организовать 14 мышей в пробных или контрольных групп с семью в каждой группе, и с тем же соотношением мужчины к женщине в каждой группе.
Затем очистите скамейку и стерилизовать ее 70% этилового спирта. Используйте лампу для обогрева одной из мышей, чтобы помочь хвостовой вене появиться. Сдерживайте мышь должным образом с помощью хеверщика для впрыска хвоста.
Ввилите MM.1S-luc/mCherry клетки в 50 микролитров PBS через хвостовую вену. Нажмите на место инъекции спиртового тампона в течение 30 секунд. Затем отметите впрыснутую мышь и верните ее в чистую клетку.
На седьмой день, после инъекции клеток MM1S, ввимите 50 микролитров PBS, содержащих одностенный углеродный нанотрубок анти-MALAT1 в хвостовую вену мыши. Затем нажмите на место инъекции спиртовой мазок в течение 30 секунд. Наблюдайте за локальным кровотечением на хвосте и общим поведением мыши в течение одной минуты, а затем верните его в чистую клетку.
Наблюдайте все введенные мыши снова перед возвращающ клеткой к стойке для того чтобы убеждаться что впрыски допущены наилучшим образом. Взвесить каждую мышь перед вскрытием. Соберите периферическую кровь из сердца для полного анализа крови, выполняемого банкоматом счетчика клеток крови.
Затем соберите ткани костного мозга, селезенки, лимфатических узлов, почек и тканей с видимыми метастазами. Извлекайте РНК и белок из образцов костного мозга. Исправить все оставшиеся ткани в формалин.
После 24 часов фиксации, погрузите образцы костей в 0,5-молярный раствор ЭДТА в течение пяти дней для декалькации. Затем погрузите все образцы в 75%-ный этиловый спирт для длительного хранения. Результаты ПЦР ПО показали, что анти-МАЛАТ1 gapmeR ДНК сбил выражение MALAT1 и индуцированных апоптоза значительно в H929 и MM.1S клеток.
Одностенный углеродный нанотрубок anti-MALAT1-Cy3 был доставлен в ядро клеток ММ и значительно подавлял эндогенный уровень MALAT1 как в клетках H929, так и в MM.1S. Жизнеспособность клетки BMEC-1 не имеет существенной разницы после обработки одностенных углеродных нанотрубок анти-MALAT1-Cy3 или контроля в различных дозах и точках времени. Это указывает на то, что токсичность одностенной углеродной нанотрубки anti-MALAT1-Cy3 имеет ограниченную и приемлемую токсичность для нормальных клеток в высокой дозировке.
Для оценки воздействия одностенной углеродной нанотрубки anti-MALAT1 in vivo была создана модель мыши, распространяемая человеком MM. Люциферон сигналы мышей в одностенной углеродной нанотрубки анти-MALAT1 группы лечения были удивительно ниже по сравнению с контролем после 21 дней лечения. Из этих результатов был сделан вывод, что одностенный углеродный нанотрубок анти-MALAT1 лечения с помощью внутривенных инъекций может доставить анти-MALAT1 олиго в опухолевые клетки эффективно.
Никаких существенных побочных эффектов лечения не наблюдалось, что свидетельствует о том, что одностенный углеродный нанотрубок анти-MALAT1 инъекции является безопасным лечением для мышей. При попытке этой процедуры, важно помнить, что состав молекулы клетки будет влиять на доставку, эффективность и терапевтический эффект олигонуклеотидных препаратов. После этой процедуры, другие методы, такие как спряжение белков или малых молекул могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы.
Например, использование одностенных углеродных нанотрубок для доставки других лекарств.
