El método que estamos utilizando aquí puede ayudar a empaquetar oligonucleótidos con nanotubo de carbono de pared única, que es un nuevo tipo de nanopartícula para la administración de fármacos. La principal ventaja de esta técnica es la entrega más eficiente de fármacos oligonucleótidos en células in vivo. Las implicaciones de esta técnica se extienden a la investigación de mieloma múltiple, porque ha introducido nanopartículas para mejorar la entrega de fármacos oligonucleótidos.
A través de este método puede proporcionar información sobre el tratamiento para el mieloma múltiple. También se puede aplicar a otras enfermedades y conjugar con otra carga, como proteínas y moléculas pequeñas. En primer lugar, mezcle un miligramo de nanotubos de carbono de una sola pared, cinco miligramos de amina DSPE-PEG 2000 y cinco mililitros de agua esterilizada sin nucleasas en un vial de centelleo de vidrio de 20 mililitros.
Sonicar el vial en un sonicador de baño de agua a un nivel de potencia de 90 vatios durante una hora a temperatura ambiente. Después de la sonicación, centrifugar el vial a 24.000 g durante seis horas. A continuación, recoja la solución de sobrenadante.
Añada un mililitro de la solución de nanotubo de carbono de una sola pared a un dispositivo de filtro centrífugo de corte de peso molecular de 100 kilodalton seguido de cuatro mililitros de agua esterilizada sin nucleasa. Centrifugar durante 10 minutos a 4.000 g a temperatura ambiente para eliminar el exceso de amina. Agregue 0,5 miligramos de Sulfo-LC-SPDP a 450 microlitros del nanotubo de carbono de una sola pared funcionalizado por amina.
A continuación, añadir 50 microlitros de 10x PBS, e incubar durante dos horas a temperatura ambiente. A continuación, añada la mezcla de reacción a un dispositivo de filtro centrífugo de corte de peso molecular de 100 kilos de kilodalton, seguido de cuatro mililitros de agua libre de nucleasas. Centrifugar la muestra durante 10 minutos a 4.000 g a temperatura ambiente para eliminar el exceso de Sulfo-LC-SPDP.
Recoja la solución de nanotubo de carbono de una sola pared tratada con Sulfo-LC-SPDP que queda en el filtro y diluya con 500 microlitros de solución anti-MALAT1-Cy3 previamente preparada. Luego incubar la muestra a cuatro grados centígrados durante la noche. Para lograr los mejores resultados de la comparación, organice aleatoriamente 14 ratones en grupos de ensayo o control con siete en cada grupo, y con la misma relación hombre-mujer en cada grupo.
A continuación, limpie el banco de operaciones y el esterilice con 70% de alcohol etílico. Utilice una lámpara de calentamiento para calentar uno de los ratones para ayudar a que aparezca la vena de la cola. Sujete el ratón correctamente con un limitador de inyección de cola.
Inyectar células MM.1S-luc/mCherry en 50 microlitros de PBS a través de la vena de la cola. Presione el lugar de inyección con un hisopo de alcohol durante 30 segundos. A continuación, marque el ratón inyectado y devuélvalo a una jaula limpia.
En el día siete, después de la inyección celular MM1S, inyecte 50 microlitros de PBS que contengan nanotubo de carbono de una sola pared anti-MALAT1 en la vena de la cola del ratón. A continuación, presione el lugar de inyección con un hisopo de alcohol durante 30 segundos. Observe el sangrado local en la cola y el comportamiento general del ratón durante un minuto, y luego devuélvalo a una jaula limpia.
Observe todos los ratones inyectados de nuevo antes de devolver la jaula al bastidor para asegurarse de que las inyecciones se toleran bien. Pesar cada ratón antes de la disección. Recoger la sangre periférica del corazón para un ensayo completo de hemograma realizado por una máquina contadora de células sanguíneas.
A continuación, recoja los tejidos de la médula ósea, el bazo, el ganglio linfático, el riñón y el tejido con metástasis visible. Extraiga ARN y proteína de las muestras de médula ósea. Arregla todos los tejidos restantes en formalina.
Después de 24 horas de fijación, sumerja las muestras óseas en una solución EDTA de 0,5 molares durante cinco días para la descalcificación. A continuación, sumerja todas las muestras en 75% alcohol etílico para su almacenamiento a largo plazo. Los resultados de QRT PCR mostraron que el ADN anti-MALAT1 gapmeR derribó la expresión MALAT1 e indujo apoptosis significativamente en células H929 y MM.1S.
Nanotubo de carbono de pared única anti-MALAT1-Cy3 fue entregado en el núcleo de las células MM, y suprimió significativamente el nivel ENDógeno MALAT1 en las células H929 y MM.1S. La viabilidad de la célula BMEC-1 no tiene ninguna diferencia significativa después del tratamiento del nanotubo de carbono de una sola pared anti-MALAT1-Cy3 o el control en diferentes dosis y puntos de tiempo. Esto indica que la toxicidad de nanotubos de carbono de pared única anti-MALAT1-Cy3 tiene una toxicidad limitada y aceptable para las células normales a dosis altas.
Se estableció un modelo de ratón diseminado por MM humano para evaluar los efectos del tratamiento de nanotubos de carbono de una sola pared anti-MALAT1 in vivo. Las señales de luciferon de ratones en el grupo de tratamiento anti-MALAT1 de nanotubos de carbono de una sola pared fueron notablemente más bajas en comparación con el control después de 21 días de tratamiento. A partir de estos resultados, se concluyó que el tratamiento anti-MALAT1 de nanotubo de carbono de una sola pared a través de inyección intravenosa podría administrar los oligos anti-MALAT1 a las células tumorales de manera eficaz.
No se observaron efectos secundarios significativos del tratamiento, lo que indica que la inyección anti-MALAT1 de nanotubo de carbono de una sola pared es un tratamiento seguro para ratones. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la composición de la molécula celular influirá en la entrega, eficiencia, y el efecto terapéutico de los fármacos oligonucleótidos. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la conjugación de proteínas o moléculas pequeñas para responder preguntas adicionales.
Como usar nanotubos de carbono de una sola pared para suministrar otros medicamentos.
