המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך במבחנה, את ההשפעה של השהיה היפוך סוכנים על עיבוד MRNA HIV. הפרוטוקול מספק שיטה יעילה ואמינה פשוטה להערכת, בו זמנית את ההשפעה של LRA על שעתוק HIV ושזור. טכניקה זו סיפקה תובנה על היכולת של LRAs לגרום להפעלה מחדש של וירוסים וסיווג של המאגר הסמוי.
לאחר טיפוח תאים, מקום 20, 000 מהם 100 microliters של מדיום DMEM, בתוספת 10% FBS, וללא אנטיביוטיקה בארות של צלחת תחתונה שטוחה 96 היטב במשך 24 שעות. למחרת לדלל את מבנה כתב צבע כפול. ה-DNA של Tat ו-Rev ב-50 מיקרוליטרים של מדיום נטול סרום, ומערבבים בעדינות.
מערבבים בעדינות את ריאגנט השומנים, ולאחר מכן מדללים 0.65 מיקרוליטרים שלו לכל תגובה ב-50 מיקרוליטרים של מדיום נטול סרום. מערבבים בעדינות, ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. מערבבים את ריג'נט השומנים המדולל עם הדנ"א המדולל ומערבבים בעדינות.
דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. לאחר מכן, לוותר על 100 microliters של זה תסביך DNA ריג'נט השומנים טיפה חכם, על גבי התאים בכל באר. מטלטלים את הצלחת בעדינות קדימה ואחורה כדי לערבב.
ולהדגור את הצלחת באינקובטור לח, ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך חמש שעות. לאחר מכן, להדביק בארות נוספות עם 100 ננוגרם של CMV מונחה EGFP ו DsRed אקספרס DNA פלסמיד למטרות פיצוי. כדי להתחיל, לדלל כל סוכן היפוך השהיה למצב העבודה המתאים עם מדיום הצמיחה.
בעזרת ראש צינור רב-ערוצי, ישאףו בזהירות את מדיום ההמרה, והחליפו אותו ב-100 מיקרוליטרים של מדיום המכילים את סוכן היפוך ההשהיה המתאים. דגירה באינקובטור לח ב 37% צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך 48 שעות. כדי להתחיל להכתים את התאים, השתמש בראש צינור רב ערוצי כדי להוסיף 100 מיקרוליטרים של PBS לכל באר.
יש להצינור בעדינות את הראש למעלה ולמטה בערך חמש פעמים. תוך הקפדה להימנע מקצף כדי לנתק את התאים לתוך התקשורת. לאחר מכן, להעביר את התאים לתוך הבאר של צלחת V-התחתון 96 היטב.
צנטריפוגה בכבידה של פי 500 וב-4 מעלות צלזיוס לחמש דקות. שאף את המדיום ואת PBS מבלי לגעת בתאים. לשטוף את התאים לפחות פעם אחת עם 200 microliters של חלבון PBS ללא סרום.
צנטריפוגה בכבידה של פי 500 וב-4 מעלות צלזיוס לחמש דקות. להטות את הצלחת כדי להשליך את supernatant ולהסיר את מאגר לשטוף מבלי לגעת בתאים. לאחר מכן לדלל את צבע הכדאיות הקבוע בחלבון ו PBS ללא סרום ביחס של 1 עד 1000, כדי להכין פתרון עובד.
מוסיפים 50 מיקרוליטרים של הצבע המדולל לכל באר, ומצינורים למעלה ולמטה כדי לערבב. דגירה בארבע מעלות צלזיוס. בעוד מוגן מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום במשך 10 עד 15 דקות.
לאחר מכן לשטוף את התאים פעם או פעמיים עם 150 microliters של חיץ לשטוף. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 500 פעמים כבידה, וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולהשליך את העל טבעי. כדי לתקן את התאים, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של 1%פורמלדהיד טרי וחוצץ שטיפה.
ודגירה בארבע מעלות צלזיוס בעוד מוגן מפני אור במשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן, לשטוף את התאים פעם או פעמיים עם 100 microliters של חיץ לשטוף. צנטריפוגה בכבידה של פי 500 וב-4 מעלות צלזיוס לחמש דקות.
השליכו את העל-טבעי, והתינו מחדש את גלולת התא ב-70 מיקרוליטרים של חיץ שטיפה. לאחר בדיקת הביצועים והרגישות של הגדרות הציטרומטר על ידי הפעלת קדילי כיול, כוונן את מתחי הפיזור קדימה וצד עם מדגם לא מוכתם, כך שהאוכלוסייה הראשית תהיה על המסך ותובחנה בבירור. בצע פיצוי ידני או אוטומטי באמצעות דגימות מוכתמות יחיד, הבטחת לשפוך מינימלי על האוכלוסייה החיובית EGFP לתוך גלאי DsRed ולהיפך.
באמצעות הפלואורסצנטיות מינוס אחד שולט, ליצור חלקות ולהגדיר את השערים. לאחר מכן, התאימו את מתחי הפיזור קדימה וצד עם מדגם לא מוכתם, כך שהאוכלוסייה העיקרית נמצאת על המסך ומובחנת בבירור. רכוש והקליט מינימום של 10,000 אירועי תאים בני קיימא לכל מדגם.
לאחר מכן, השתמש בתוכנה לניתוח נתונים של cytometry זרימה כדי לנתח את הנתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. תוצאות מייצגות לביטוי של HIV-1, מוצרים לא מרוסנים ושזורים, לאחר טיפול עם מעכבי bromodomain JQ1, מראים כי הן JQ1 חיובי ו Tat, להגדיל באופן משמעותי את אחוז התאים המבטאים EGFP. מה שמעיד על תעתיקים לא מרוסנים.
JQ1 חיובי נראה גם להגדיל באופן משמעותי את אחוז התאים המבטאים DsRed. ולהגדיל את חלקו של מוצר שאנחנו שותק לרמות דומות כמו Tat. זה מאשר את היכולת של JQ1 חיובי להפעיל שעתוק HIV ושזור.
עם זאת, טיפול עם שליטה stereoisomer JQ1 שלילי, מבטל את ההשפעה החיובית JQ1 על שעתוק HIV ושזור. לאחר השליטה, שיטה זו יכולה להתבצע באמצעות תרופות בנפרד או בשילוב. בודקים את היכולת שלהם לסינרגיה ביעילות.
מה שיוביל למינון נמוך יותר של התרופה ורעילות. לאחר כל התפתחות, טכניקה זו סללה את הדרך לבדיקת שילובי תרופות יעילים במודלים ראשוניים של השהיה בדגימות של מטופלי אקס ויוו.
