このプロトコルは、電気泳動中のDNA検出に臭化エチジウムを使用する簡単で安価な代替手段です。臭化エチジウムを除去することにより、UV光または青色光のいずれかを検出に使用することができる。青色光はDNAにダメージを与えるものではなく、下流の実験の成功の可能性を高めます。
これを試すのは本当に簡単です。ゲルの臭化エチジウムをチアゾールオレンジに置き換えるだけです。始めに、トリス-酢酸-EDTAまたはトリスホウ酸塩バッファーの70ミリリットルにアガロースの約0.7グラムを混合することによって1%ミニゲルを調製します。
次に、DMSOにチアゾールオレンジを溶解し、10,000Xストック溶液を作る。特に光に敏感ではないが、使用していないときに暗闇の中でチアゾールオレンジを保存します。長期保存のために、チアゾールオレンジDMSO混合物のアリコートを作り、それらを凍結する。
次に、1ミリリットル当たり1.3マイクログラムの最終濃度にチアゾールオレンジを加え、アガロースバッファーとチアゾールオレンジの混合物をマイクロ波にしてアガロースを約60秒間溶解させた。適切な櫛を含むゲル鋳造装置にアガロース混合物を注ぎ、アガロース溶液をゲルに固化させます。ゲルをロードするには、まず、ゲルを電気泳動装置に入れ、まだ存在しない場合。
次に、TAE または TBE ランニング バッファーを追加して、ゲルの表面を覆います。次に、負荷染料を用いて、DNAサンプルの10マイクロリットルをロードする。参照用のDNAサイジングラダーを含めます。
カバーと電極を取り付け、ローディング染料がミニジェルのために約4〜7センチメートル移動するまで、ミニゲルを100ボルトで実行します。ゲル鋳造前にチアゾールオレンジを塗布しなかった場合は、チアゾールオレンジを含む緩衝液に浸してゲルを約20分間、またはバンドが完全に検出されるまで穏やかに撹拌して染色する。UVトランイルミエータを用いてゲルを可視化するには、電気泳動装置からゲルを取り出し、UVトランスイルミエータに置きます。
青色光トランイルミエーターまたは懐中電灯を使用してゲルを可視化するには、青色光トランイルミエータにゲルを置くか、青色のLED懐中電灯を上または下からゲルに向けます。オレンジ色のDNAから蛍光を可視化し、色素を保護するために、青色光を除外するためにアンバーエミッションフィルターを使用してください。さらなる消化または結紮のために、ゲルから所望のDNAバンドを切り取り、容易に入手可能なキットまたはプロトコルを使用してDNAを抽出する。
ゲルイメージング装置で適切な励起および発光設定を選択します。適切なフィルターを備えたイメージングシステムがない場合は、カメラとゲルブルーライト励起源の間にオレンジ色のフィルターを配置します。検出限界は、臭化エチジウム、チアゾールオレンジ、および一般的な青色光検出可能な市販DNA染料の間で類似しており、3つの色素の検出限界はミニゲル内のレーンあたり1〜2ナノグラムである。
制限消化のチアゾールオレンジ染色アガロースゲルは、UVまたは青色光の経照度器または青色光懐中電灯で励起されたときに検出可能である。チアゾールオレンジは臭化エチジウムよりも危険ではないようですが、手袋やゴーグルなどの標準的な個人用保護具は着用する必要があります。
