Электрофорез ДНК, вместо тиазол оранжевый бромид Ethidium или альтернативных красители

Этот протокол является легкой и недорогой альтернативой использованию бромистого этидия для обнаружения ДНК во время электрофореза. Удалив бромид этидия, для обнаружения можно использовать ультрафиолетовый или синий свет. Синий свет не повреждает ДНК, что повышает шансы на успех для экспериментов ниже по течению.

Это действительно легко попробовать это. Вы просто должны заменить бромид этидия в гелях с тиазол оранжевый. Для начала приготовьте 1%мини-гелей, смешивая примерно 0,7 грамма агарозы в 70 миллилитров трис-ацетат-ЭДТА или трис-борат буферов.

Затем растворите тиазол оранжевый в DMSO, чтобы сделать 10,000X фондовый раствор. Хотя не особенно свет чувствительны, хранить тиазол оранжевый в темноте, когда не используется. Для длительного хранения сделайте алициты из смеси тиазол оранжево-DMSO и заморозьте их.

Затем добавьте тиазоловый апельсин в окончательную концентрацию 1,3 микрограмма на миллилитр, и микроволновая печь смесь буфера агарозы и апельсина тиазола растворить агарозу в течение примерно 60 секунд. Налейте смесь агарозы в гель литья аппарат, содержащий соответствующий гребень, и позволяют раствор агарозы затвердеть в гель. Чтобы загрузить гель, сначала поместите гель в электрофорезный аппарат, если его уже нет.

Затем добавьте taE или TBE бегущий буфер, чтобы покрыть поверхность геля. Далее, используя погрузочный краситель, загрузите 10 микролитров образца ДНК. Включите лестницу размеров ДНК для справки.

Прикрепите крышку и электроды, и запустить мини-гель на 100 вольт, пока погрузочный краситель путешествует примерно четыре-семь сантиметров для мини-гель. Если тиазол оранжевый не был применен до литья геля, пятно гель, погрузив его в буфер, содержащий тиазол оранжевый с нежным возбуждением в течение 20 минут или до тех пор, пока полосы полностью обнаружены. Чтобы визуализировать гель с помощью УФ-трансиллюминатора, удалите гель из электрофорезного аппарата и поместите его на УФ-трансиллюминатор.

Чтобы визуализировать гель с помощью синего светового трансиллюминатора или фонарика, поместите гель на синий свет трансиллюминатор или направить синий светодиодный фонарик на гель сверху или снизу. Используйте фильтр выбросов янтаря, чтобы отфильтровать синий свет, что позволяет визуализировать флуоресценцию из ДНК тиазол оранжевых комплексов и для защиты красителей. Для дальнейшего пищеварения или перевязки, вырезать желаемые полосы ДНК из геля и приступить к извлечению ДНК с помощью легко доступны комплекта или протокола.

Выберите соответствующие настройки возбуждения и выбросов в гелеобразующей аппарате. При отсутствии системы визуализации с соответствующими фильтрами поместите янтарный фильтр между камерой и гелем синего света источника возбуждения. Пределы обнаружения аналогичны между бромистым этидием, тиазол-оранжевым и обычным коммерческим красителем ДНК, обнаруживаемым синим светом, при этом предел обнаружения всех трех красителей составляет от одного до двух нанограммов на полосу в мини-геле.

Тиазол оранжевый окрашенных агароза гель ограничения дайджест обнаруживается, когда он возбужденных с УФ или синий свет трансиллюминатора или с синим фонариком света. Хотя тиазол оранжевый, как представляется, менее опасны, чем бромид этидия, стандартные средства индивидуальной защиты, такие как перчатки и очки по-прежнему следует носить.