Dieses Protokoll ist eine einfache und kostengünstige Alternative zur Verwendung von Ethidiumbromid zur DNA-Detektion während der Elektrophorese. Durch die Entfernung von Ethidiumbromid kann entweder UV-Licht oder blaues Licht zur Detektion verwendet werden. Blaues Licht ist nicht schädlich für die DNA, was die Erfolgsaussichten für nachgelagerte Experimente verbessert.
Es ist wirklich einfach, dies auszuprobieren. Sie müssen nur das Ethidiumbromid in Ihren Gelen durch Thiazol-Orange ersetzen. Zu Beginn bereiten Sie 1%Mini-Gele vor, indem Sie etwa 0,7 Gramm Agarose in 70 Milliliter Tris-Acetat-EDTA oder Tris-Borate-Puffer mischen.
Als nächstes lösen Sie Thiazol-Orange in DMSO auf, um eine 10, 000X-Lagerlösung herzustellen. Obwohl nicht besonders lichtempfindlich, speichern Thiazol Orange im Dunkeln, wenn nicht in Gebrauch. Zur Langzeitlagerung Aliquots der Thiazol-Orange-DMSO-Mischung herstellen und einfrieren.
Dann thiazol orange zu einer Endkonzentration von 1,3 Mikrogramm pro Milliliter hinzufügen, und Mikrowelle die Mischung aus Agarose Puffer und Thiazol Orange, um Agarose für etwa 60 Sekunden aufzulösen. Gießen Sie die Agarose-Mischung in ein Gelgussgerät, das einen geeigneten Kamm enthält, und lassen Sie die Agarose-Lösung zu einem Gel verfestigen. Um das Gel zu laden, legen Sie zuerst das Gel in die Elektrophorese-Apparatur, wenn nicht bereits vorhanden.
Fügen Sie dann TAE- oder TBE-Laufpuffer hinzu, um die Oberfläche des Gels zu bedecken. Als nächstes, mit einem Ladefarbstoff, laden Sie 10 Mikroliter einer DNA-Probe. Fügen Sie eine DNA-Größenleiter als Referenz ein.
Befestigen Sie die Abdeckung und die Elektroden und führen Sie das Mini-Gel bei 100 Volt aus, bis der Ladefarbstoff für ein Mini-Gel etwa vier bis sieben Zentimeter zurücklegt. Wenn Thiazol-Orange vor dem Gelguss nicht aufgetragen wurde, färben Sie das Gel, indem Sie es in den Puffer eintauchen, der Thiazol-Orange mit sanfter Rührung für etwa 20 Minuten enthält, oder bis die Bänder vollständig erkannt sind. Um das Gel mit einem UV-Transilluminator zu visualisieren, entfernen Sie das Gel aus dem Elektrophoresegerät und legen Sie es auf den UV-Transilluminator.
Um das Gel mit einem Blaulichttransilluminator oder einer Taschenlampe zu visualisieren, legen Sie das Gel auf den blauen Lichttransilluminator oder richten Sie die blaue LED-Taschenlampe von oben oder unten an das Gel. Verwenden Sie einen Bernstein-Emissionsfilter, um das blaue Licht herauszufiltern, um die Fluoreszenz aus DNA-Thiazol-Orangenkomplexen zu veranagen und Farbstoffe zu schützen. Für die weitere Verdauung oder Ligation, schneiden Sie gewünschte DNA-Bänder aus dem Gel und fahren Sie mit einem leicht verfügbaren Kit oder Protokoll zu extrahieren.
Wählen Sie die entsprechenden Anregungs- und Emissionseinstellungen im Gel-Imaging-Gerät aus. In Ermangelung eines Bildgebungssystems mit entsprechenden Filtern, legen Sie einen Bernsteinfilter zwischen die Kamera und das Gel Blaulicht-Anregungsquelle. Die Nachweisgrenzen sind ähnlich zwischen Ethidiumbromid, Thiazolorange und einem gemeinsamen blaulichtnachweisbaren kommerziellen DNA-Farbstoff, wobei die Nachweisgrenze für alle drei Farbstoffe ein bis zwei Nanogramm pro Spur in einem Mini-Gel beträgt.
Thiazol orange-gefärbtes Agarose-Gel eines Restriktions-Digests ist nachweisbar, wenn es mit einem UV- oder Blaulichttransilluminator oder mit einer blaulichten Taschenlampe angeregt wird. Während Thiazol-Orange weniger gefährlich zu sein scheint als Ethidiumbromid, sollten standardmäßige persönliche Schutzausrüstungen wie Handschuhe und Schutzbrillen getragen werden.
