이 프로토콜은 전기 전구 중 DNA 검출을 위해 에디듐 브로마이드를 사용하는 쉽고 저렴한 대안입니다. 에티듐 브로마이드를 제거함으로써 UV 라이트 또는 청색광을 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 청색광은 DNA에 손상을 입히고 다운스트림 실험의 성공 가능성을 향상시킵니다.
이 것을 시도하는 것은 정말 쉽습니다. 젤의 에티듐 브로마이드를 티아졸 오렌지로 교체하기만 하면 됩니다. 시작하려면 약 0.7 그램의 아가로즈를 tris-acetate-EDTA 또는 트라이스 보레이트 버퍼70 밀리리터에 혼합하여 1%mini-gels를 준비하십시오.
다음으로, DMSO에 티아졸 오렌지를 녹여 10, 000X 스톡 솔루션을 만듭니다. 특히 가벼운 민감하지는 않지만 사용하지 않을 때는 티아졸 오렌지를 어둠 속에서 보관하십시오. 장기 보관을 위해 티아졸 오렌지-DMSO 혼합물의 알리쿼트(aliquots)를 만들어 동결하십시오.
그런 다음, 티아졸 오렌지를 밀리리터당 1.3 마이크로그램의 최종 농도에 넣고 아가로즈 버퍼와 티아졸 오렌지의 혼합물을 전자레인지에 넣고 약 60초 동안 아가로즈를 녹입니다. 아가로즈 혼합물을 적절한 빗을 함유한 젤 주조 장치에 붓고, 아가로즈 용액이 젤로 고화되도록 한다. 젤을 적재하기 위해, 먼저 겔을 전기전도 장치에 배치하고, 아직 존재하지 않는 경우.
그런 다음 TAE 또는 TBE 실행 버퍼를 추가하여 젤 표면을 덮습니다. 다음으로, 로딩 염료를 사용하여 DNA 샘플의 10 마이크로리터를 적재합니다. 참조를 위해 DNA 크기 조정 사다리를 포함한다.
커버와 전극을 부착하고, 로딩 염료가 미니 젤을 위해 약 4~7cm까지 주행할 때까지 100볼트에서 미니 젤을 실행합니다. 티아졸 오렌지가 젤 주조 전에 적용되지 않은 경우, 약 20분 동안 또는 밴드가 완전히 검출될 때까지 티아졸 오렌지를 함유한 완충제에 침지하여 젤을 얼룩지게 한다. UV 트랜틸루미나이터를 사용하여 젤을 시각화하려면 전기 전광 장치에서 젤을 제거하고 UV 트랜틸루미노이터에 배치하십시오.
청색광 트랜실루미나이터 또는 손전등을 사용하여 젤을 시각화하려면, 젤을 블루라이트 트랜실루미노이터에 놓거나 위 또는 아래에서 젤에 파란색 LED 손전등을 직접 배치한다. 호박색 방출 필터를 사용하여 청색광을 걸레로 하여 DNA 티아졸 오렌지 복합체에서 형광을 시각화하고 염료를 보호합니다. 추가 소화 또는 결찰을 위해, 젤에서 원하는 DNA 밴드를 잘라 쉽게 사용할 수있는 키트 또는 프로토콜을 사용하여 DNA를 추출진행합니다.
젤 이미징 장치에서 적절한 여기 및 방출 설정을 선택합니다. 적절한 필터가 있는 이미징 시스템이 없는 경우 카메라와 젤 블루라이트 여기 소스 사이에 호박색 필터를 놓습니다. 검출 한계는 에티듐 브로마이드, 티아졸 오렌지 및 일반적인 청색 광 검출 가능한 상업용 DNA 염료 와 유사하며, 세 개의 염료에 대한 검출 제한은 미니 젤의 차선당 1~2나노그램입니다.
제한 다이제스트의 티아졸 오렌지 스테인드 아가로즈 젤은 UV 또는 블루 라이트 트랜실루미나이터 또는 청색 조명 손전등으로 흥분할 때 감지할 수 있습니다. 티아졸 오렌지는 에티듐 브로마이드보다 덜 위험해 보이지만 장갑과 고글과 같은 표준 개인 보호 장비는 여전히 착용해야 합니다.
