Bu protokol elektroforez sırasında DNA tespiti için ethidyum bromür kullanmaya kolay ve ucuz bir alternatiftir. Ethidyum bromür çıkarılarak, uv ışığı veya mavi ışık algılama için kullanılabilir. Mavi ışık DNA'ya zarar vermez, bu da alt akım deneylerinde başarı şansını artırır.
Bunu denemek çok kolay. Sadece tiamit turuncu ile jeller içinde ethidium bromür değiştirmeniz gerekir. Başlamak için, tris-asetat-EDTA veya tris-borat tamponlar 70 mililitre agarose yaklaşık 0,7 gram karıştırarak% 1 mini jeller hazırlamak.
Daha sonra, 10, 000X stok çözeltisi yapmak için DMSO tiazol turuncu eritin. Özellikle ışığa duyarlı olmasa da, kullanılmadığı zaman karanlıkta tiamzol turuncusaklayın. Uzun süreli depolama için, tiazol portakal-DMSO karışımı aliquots yapmak ve onları dondurmak.
Sonra, mililitre başına 1.3 mikrogram son konsantrasyona tiazol portakal ekleyin ve yaklaşık 60 saniye agarose çözmek için agarose tampon ve tiamit turuncu karışımı mikrodalga. Uygun bir tarak içeren bir jel döküm aparat içine agarose karışımı dökün ve bir jel içine katılaşmak için agarose çözeltisi sağlar. Jeli yüklemek için, jeli ilk olarak elektroforez cihazına yerleştirin.
Sonra jel yüzeyini kapsayacak şekilde TAE veya TBE çalışan tampon ekleyin. Sonra, yükleme boyası kullanarak, bir DNA örneğinin 10 mikrolitresini yükleyin. Referans için bir DNA boyutlandırma merdiveni ekleyin.
Kapağı ve elektrotları takın ve mini jeli 100 voltta çalıştırın, ta ki yükleme boyası bir mini jel için yaklaşık 4-7 santimetre gidene kadar. Tiazol portakalı jel dökümden önce uygulanmamışsa, jeli tiamzol içeren tampona batırarak yaklaşık 20 dakika veya bantlar tam olarak tespit edilene kadar hafif ajitasyonla lekeleyin. Jeli UV transilluminator kullanarak görselleştirmek için, jeli elektroforez cihazından çıkarın ve UV transilluminator'un üzerine yerleştirin.
Jeli mavi ışık transilluminator veya el feneri kullanarak görselleştirmek için, jeli mavi ışık transilluminator'un üzerine yerleştirin veya mavi LED el fenerini jelin üstünden veya altından yönlendirin. Mavi ışığı filtrelemek için kehribar emisyon filtresi kullanın, DNA tiazol turuncu komplekslerinden floresan görselleştirmesini ve boyaları korumasını sağlar. Daha fazla sindirim veya ligasyon için, jel istenilen DNA bantları kesip ve hazır bir kit veya protokol kullanarak DNA ayıklama devam.
Jel görüntüleme cihazında uygun uyarma ve emisyon ayarlarını seçin. Uygun filtrelere sahip bir görüntüleme sistemi yokluğunda, kamera ile jel mavi ışık uyarma kaynağı arasına bir kehribar filtre yerleştirin. Algılama limitleri ethidium bromür arasında benzer, tiazol turuncu, ve ortak bir mavi-ışık tespit edilebilir ticari DNA boyası, her üç boya için algılama sınırı bir mini jel şerit başına bir ila iki nanogram olmak.
Bir kısıtlama sindirim Thiazolturuncu lekeli agarose jel bir UV veya mavi ışık transilluminator veya mavi ışık el feneri ile heyecanlı zaman tespit edilebilir. Tiayzol portakalı ethidyum bromürden daha az tehlikeli görünse de eldiven ve gözlük gibi standart kişisel koruyucu ekipmanlar hala giyilmelidir.
