التفريد الحمض النووي باستخدام أورانج Thiazole بدلاً من اثيديوم بروميد أو الأصباغ البديلة

هذا البروتوكول هو بديل سهل وغير مكلف لاستخدام بروميد الإثيديوم للكشف عن الحمض النووي أثناء الكهرباء. عن طريق إزالة بروميد الإثيديوم، يمكن استخدام الأشعة فوق البنفسجية أو الضوء الأزرق للكشف. الضوء الأزرق لا يضر بالحمض النووي، مما يحسن فرصة النجاح للتجارب المصب.

من السهل حقاً تجربة هذا الأمر. عليك فقط استبدال بروميد الإثيديوم في المواد الهلامية الخاصة بك مع برتقال الثيازول. للبدء، إعداد 1٪ من الهلول الصغيرة عن طريق خلط ما يقرب من 0.7 غرام من agarose في 70 ملليلتر من تريس-أسيتات-EDTA أو مخازن تريس بورات.

بعد ذلك، حل الثيازول البرتقالي في DMSO لجعل 10، 000X حل الأسهم. في حين لا حساسية الضوء بشكل خاص، وتخزين برتقالة الثيازول في الظلام عندما لا تكون قيد الاستخدام. لتخزين على المدى الطويل، وجعل aliquots من خليط الثيازول البرتقالي DMSO وتجميدها.

ثم، إضافة برتقال الثيازول إلى تركيز النهائي من 1.3 ميكروغرام لكل ملليلتر، وميكروويف خليط من العازلة agarose والبرتقال الثيازول إلى حل agarose لمدة 60 ثانية تقريبا. صب خليط agarose في جهاز صب هلام تحتوي على مشط المناسبة، والسماح لحل agarose لترسيخ في هلام. لتحميل الجل، المقام الأول الجل في الجهاز الكهربائي، إن لم يكن موجود بالفعل.

ثم إضافة TAE أو TBE تشغيل المخزن المؤقت لتغطية سطح الجل. بعد ذلك ، باستخدام صبغة التحميل ، قم بتحميل 10 ميكرولترات من عينة الحمض النووي. وتشمل سلم التحجيم الحمض النووي للرجوع اليها.

إرفاق الغطاء والأقطاب الكهربائية، وتشغيل هلام مصغرة في 100 فولت حتى صبغة التحميل يسافر ما يقرب من أربعة إلى سبعة سنتيمترات لجل مصغرة. إذا لم يتم تطبيق برتقالة الثيازول قبل صب الجل، وصمة عار هلام عن طريق غمره في المخزن المؤقت الذي يحتوي على البرتقال الثيازول مع التحريض لطيف لحوالي 20 دقيقة أو حتى يتم الكشف عن العصابات تماما. لتصور الجل باستخدام transilluminator الأشعة فوق البنفسجية، وإزالة هلام من الجهاز الكهربائي ووضعها على transilluminator الأشعة فوق البنفسجية.

لتصور الجل باستخدام جهاز نقلان خفيف أزرق أو مصباح يدوي، ضع الجل على جهاز الترانوميميناتور الضوئي الأزرق أو قم بتوجيه مصباح LED الأزرق في الجل من الأعلى أو الأسفل. استخدم فلتر انبعاث العنبر لتصفية الضوء الأزرق، مما يتيح تصور الفلوريسنس من مجمعات برتقال الثيازول الحمض النووي وحماية الأصباغ. لمزيد من الهضم أو الربط، قطع عصابات الحمض النووي المطلوب من هلام والمضي قدما في استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة متاحة بسهولة أو بروتوكول.

حدد إعدادات الإثارة والانبعاثات المناسبة في جهاز التصوير الهلامي. في حالة عدم وجود نظام تصوير مع مرشحات مناسبة، ضع فلترًا من نوع العنبر بين الكاميرا ومصدر الإثارة اللاميّة ذات الضوء الأزرق. وتتشابه حدود الكشف بين بروميد الإثيديوم، والبرتقال الثيازول، وصبغة الحمض النووي التجارية الشائعة التي يمكن اكتشافها بالضوء الأزرق، مع وجود حد الكشف عن جميع الأصباغ الثلاثة واحد إلى اثنين نانوغرام في كل حارة في هلام صغير.

الثيوزول البرتقالي الملون agarose هلام من خلاصة تقييد هو الكشف عندما يكون متحمسا مع الأشعة فوق البنفسجية أو الترانويلوميناتور الضوء الأزرق أو مع مصباح يدوي الضوء الأزرق. وفي حين يبدو أن برتقال الثيازول أقل خطورة من بروميد الإثيديوم، فإنه ينبغي الاستمرار في ارتداء معدات الوقاية الشخصية القياسية مثل القفازات والنظارات الواقية.