פרוטוקול זה מייצר נתוני שעתוק תפוקה גבוהה של תאי איון אנושיים בודדים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ללמוד הטרוגניות תא אנוכרום, לזהות סוג תא נדיר, ויסות גנים במחלה. טכניקה זו מייצרת נתונים בקנה מידה גדול יותר תא יחיד, קל לשימוש, ויש לו זמן עיבוד קצר למדי. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על איונים ממינים אחרים ועל פרופיל רקמות אחרות מבודדות טרי.
עם זאת, יש לייעל את הפרוטוקול כך שיתאים להליכי דיסוציאציה ספציפיים לרקמות. זה קריטי כדי להכין תאים דיסוציאציה באיכות גבוהה. QC של ההשעיה התא לפני חלוקה למחיצות תא יחיד הוא המפתח, כמו גם טיפול אמולסיה בזהירות ובמהירות.
כמה נקודות ביקורת איכותיות כמו לדעת אם שבב סתום נראים טוב יותר מאשר לקרוא. לאחר השגת איונים אנושיים ודגירה בן לילה, לספור ולבט את היד 200 כדי 300 איונים באמצעות פיפטה P200. מעבירים את האיים לצינור חרוט 15 מ"מ המכיל חמישה מילימטרים של מדיה איון שלם, מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס.
מניחים את הצינור בצנטריפוגה ב 200 פעמים G במשך שתי דקות. שאף בעדינות את העל-טבעי מבלי להפריע לכדור בתחתית. מוסיפים מילימטר אחד של פתרון דיסוציאציה לתאים מחומם מראש ומשבשים את גלולת הכדור על ידי צינור בעדינות למעלה ולמטה.
הדגירה את איונים ב 37 מעלות צלזיוס במשך תשע עד 11 דקות. כל שלוש דקות, פיפטה למעלה ולמטה לאט במשך 10 שניות כדי לנתק את התאים לתאים בודדים. לאחר שתאי האיון נותק היטב והפתרון הופך מעונן, הוסף תשעה מיליליטר של מדיית איון מלאה וסנן דרך מסננת תאים של 30 מיקרומטר לצינור חרוט חדש של 15 מיליליטר.
לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 400 פעמים G במשך חמש דקות. שאף את העל-טבעי והשהה מחדש את גלולת התא ב- 200 עד 300 מיקרוליטרים של פתרון 1X PBS 04%BSA. עכשיו, לערבב 10 microliters של תרבות התא עם 0.5 microliters של AO / DAPI.
פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב ביסודיות. טען 10.5 מיקרוליטרים על שקופית והפעל את מדף ספירת התאים על מונה תאים אוטומטי מבוסס פלואורסצנטיות כדי לקבוע ספירה וכדאיות. מניחים שבב מיקרופלואידי לתוך מארז שבב.
לכוון את מקרה השבב, להבטיח בארות שמן הם הקרובים ביותר לאדם ביצוע הניסוי. השתמש פיפטה כדי להוסיף את נפח מחושב של תאים לתוך רצועות צינור מוכן. פיפטה לערבב חמש פעמים.
מבלי להשליך את קצות פיפטה, להעביר 90 microliters של תערובת התא שורה אחת של השבב. המתן 30 שניות, ואז פיפטה לאט מאוד לטעון 40 microliters של חרוזים ג'ל לשורה 2. לוותר על 270 מיקרוליטרים של שמן חלוקת ל בארות של שורה שלוש.
חבר את אטם השבב ללשונית של מחזיק השבבים. מקם את מחזיק השבבים שהורכב בהתקן החלוקה למחיצות של תא יחיד ולחץ על לחצן ההפעלה. עם השלמת הריצה, מוציאים את אטם השבב מהמחזיק, פותחים את מארז השבב בזווית של 45 מעלות ומעבירים 100 מיקרוליטרים של האמולסיה מהשבב לתוך באר בצלחת פלסטיק כחולה 65 באר.
לוותר על 125 מיקרוליטרים של אמולסיה ורודה שבירת ריאגנט לתוך כל אמולסיה. המתן דקה אחת ולאחר מכן העבר את כל הנפח של כל באר לתוך כל צינור 0.2 מיליליטר. ודא כי יש שכבה של ברור שכבה של ורוד ברצועת הצינור.
עם פיפטה, להסיר 125 microliters של השכבה הוורודה מתחתית רצועת הצינור מבלי להפריע לשכבה ברורה. זה נורמלי עבור נפח קטן של כ 15 microliters של השכבה הוורודה להישאר בצינור. לאחר מכן מוסיפים 200 מיקרוליטרים של תערובת ניקוי לכל אחת מרצועות הצינור ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
מעבירים את רצועות הצינור למצב מגנטי ומחכים שתי דקות כדי לאפשר לפתרון להתבהר. הסר את העל-טבעי והשליך. ואז לשטוף את חרוזים עם 80% אתנול פעמיים.
אפשרו ל חרוזים להתייבש למשך דקה אחת. הסר את רצועות הצינור מן המגנט ולהוסיף 35.5 microliters של פתרון אלוטיון חרוזים. פיפטה להשעות מחדש את חרוזים בתסומה דגירה במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר.
מעבירים את פסי הצינור לעמוד מגנטי ומאפשרים לפתרון להתבהר. מעבירים את הדנ"א המטוהר מרצועות הצינור כדי לנקות רצועות צינור 0.2 מיליליטר. כדי להגביר את הדנ"א המשלים, הוסיפו תחילה 65 מיקרוליטרים של תערובת ראשית של הגברה משלימה של הדנ"א לכל דגימה.
מניחים את רצועות הצינור בתרמוציקלר ולהפעיל את התוכנית על פי כתב היד. ניתן לאחסן דגימות בארבע מעלות צלזיוס עד 72 שעות. לאחר נרמול הדנ"א המשלים ל-15 היפוך אותיות ו-20 מיקרוליטרים, כ-30 מיקרוליטרים של תערובת תגים לכל דגימת דנ"א משלימה על הקרח.
שים את הדגימות בתרמוצ'יקלר והפעל את פרוטוקול התיוג ב-55 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ירידה ל-10 מעלות צלזיוס והחזקה. לאחר מכן הוסיפו 60 מיקרוליטרים של אינדקס מדגם PCR Master Mix ו-10 מיקרוליטרים של מדד דגימת פורולגול 20 מיקרומולרית לדגימה משלימה של 30 מיקרוליטר המטוהרת בדנ"א. החזירו את הצינורות לתרמוציקלר כדי להגביר את מוצר הספרייה הסופי.
לנרמל כל מדגם עם מים לשני ננוגרם למיקרוליטר ולמשוך שלושה microliters של כל מדגם מנורמל יחד בצינור 1.5 מיליליטר. מדללים את הבריכה עם מאגר אלוטיון ל-0.25 ננוגרם למיקרוליטר. Denature הבריכה על ידי שילוב של 12 microliters של מדגם הבריכה מדולל, microliter אחד של בעל חיים אחד או בקרת DNA, שני microliters של חיץ אלוטיון, וחמישה microliters של 0.4 הידרוקסיד נתרן נורמלי.
להחריג את התערובת במשך חמש דקות, ולאחר מכן להוסיף 10 microliters של טריס 200 מילימולר ב pH8, ולהעמיס 4.05 microliters של התערובת לתוך 1345.95 microliters של HTA-1. לאחר מכן, לטעון 1.3 מיליליטר לתוך מחסנית sequencer ולהפעיל בהתאם להנחיות היצרן באמצעות מתכון רצף. במחשב, הפעל את Cell Ranger כדי לבטל מולטיפלקס קבצי קריאת בסיס גולמיים שנוצרו על-ידי רצף לתוך קבצי FASTQ.
יש ליישר קבצי FASTQ להרכבת הגנום B37.3 האנושית ולהשתמש במודל הגנים של CSC כדי להשיג כימות ביטויים. בדוק את התוויית הדירוג של הברקוד כדי לוודא את ההפרדה בין הברקודים המשויכים לתא והרקע. כדי לשלוט באיכות התא, אל תכלול תאים עם פחות מ- 500 גנים שזוהו, פחות מ- 3, 000 המספר הכולל של מזהים מולקולריים ייחודיים וציון כדאיות גדול מ- 0.2.
התאימו את החתכים לפי סוגי רקמות ותאים. לאחר מכן, השתמש R חבילת mclust כדי להסיר תאים המבטאים יותר גן הורמון אחד. השתמש ב- R package seurat כדי לנרמל את ביטוי הגנים לפי סך כל המזהים המולקולריים הייחודיים ולרבות בגורם קנה מידה של 10,000 ברמת התא.
לאחר מכן לזהות גנים משתנים באמצעות הביטוי הממוצע ופיזור של כל התאים. התאימו את החתכים בהתאם לסוגי הרקמה והתאים. בצע את ניתוח הרכיב העיקרי עם הגנים המשתנים.
תאי אשכול עם מספר נבחר של רכיבים עיקריים. יש להפיק גנים מועשרים באשכול תאים על-ידי השוואת אשכול תאים אחד לשאר התאים. בפרוטוקול רצף RNA חד-תאי זה, איונים אנושיים שנרכשו נותקו תחילה כאימות על ידי תאי אלפא ובטא ב פלואורסצנטיות RNA והכלאה C2.
דוגמה מוצלחת של אמולסיה בעקבות שלב החלוקה מראה פתרון אחיד חיוור, מעונן עם שמן חלוקה מינימלי מופרד חרוזים ג'ל. לעומת זאת, אמולסיה באיכות ירודה עם הפרדת פאזה ברורה בין עוגיות הג'ל לשמן יכולה להיות בגלל סתימה במהלך הפעלת השבב. לאחר הגברה משלימה של הדנ"א, הפצה ייצוגית בגודל שבר מראה את השיא האופייני לדגימה משלימה באיכות טובה של דנ"א השוכן ליד 1,000 עד 2,000 זוגות בסיסים.
העלייה החדה ליד 600 זוגות בסיסים הייתה ספציפית לדנ"א משלים של איון. ההתפלגות בגודל קטע עבור ספריות רצף RNA הייתה בין 300 ל- 500 זוגות בסיסים. ניתוח הקיבוץ באשכולות חשף 12 סוגי תאים במרחב של מידות הטבעה סטוכסטיות של שכן שהופצו על-ידי T.
נחשפו שלוש תת-אוכלוסיות בתאי אלפא וארבעה בתאי בטא. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לבנות איונים מקיפים של תאים עבור איונים אנושיים. עם נתונים נוספים מתורמים שאינם חולי סוכרת וסוכרת, הוא משמש למשאב לגילוי יעד טיפולי.
