עריכת גנים CRISPR/Cas9 בדגים חשמליים חלשים, במיוחד בהקשר השוואתי, תאפשר לחוקרים לבדוק השערות לגבי האופן שבו גנים ספציפיים ושונות גנטית תורמים לשינויים פנוטיפיים. CRISPR/Cas9 היא שיטה יעילה ליצירת עוברי F-Zero מוטנטים. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לבצע מניפולציות CRISPR-Cas9 בשני מינים מפותחים של דגים חשמליים חלשים.
המפתח לשימוש בגישה זו עם כמה שינויים בדגים חשמליים אחרים או מיני דגים אחרים הוא הזמינות של משאבים תעתיקים או גנומיים כדי להפוך sgRNAs. ביצוע microinjections ו לדמיין את התאים במיקום 3D בתוך מישור 2D יכול להיות קשה. השג מושבת זברה קטנה לביצים כדי לתרגל טכניקות מיקרו-ג'ינג'יות כלליות.
מדגים את ההליך עם Savvas קונסטנטינו יהיה ג'ארד תומפסון, טכנאי מהמעבדה שלי. לאחר דיור מיני הדגים של עניין בתנאי הרבייה המתאימים, לזהות דגים נקבה המופיעים gravid. בB.gauderio, הנקבה תהיה גונדות נפוחות רק caudal לאוורור.
ב B.brachyistius נקבות יהיו בטן נפוחה ולהופיע עמוק גוף. לאחר ניהול הרדמה, להוסיף סוכן להשריץ ארבע פעמים את נפח DPBS בצינור PCR עם ערבוב יסודי. הפתרון יהיה מעונן.
השתמש פיפטה כדי למדוד את המינון המחושב ולחלק את הסוכן מדולל אל חתיכת תרמופלסטי לפני ציור הפתרון לתוך מזרק זכוכית מדויק מצויד 28-מד 19 כדי 25 מיליליטר אורך משופע מחט. להזריק את הפתרון לתוך שריר תא המטען הגבי בקצב חלק ולתת את המחט לשבת במשך שתיים עד ארבע שניות לפני ההסרה. לאחר מכן, מיד למקם דגים לתוך מים מערכת טריים להתאוששות.
עבור B.gauderio אוסף זרע, לאחר 24 שעות, לבחור דג זכר גדול מהר ככל האפשר לאחר סם, לייבש את הדגים ביסודיות, במיוחד סביב הראש ומאוורר. מניחים את הצד הגחוני של הדגים המיובשים למעלה, לפנים שמאלה במחזיק המתאים, מכוסים במגבת נייר לחה MS222 ספוגה עם הראש במקביל לשולחן ככל האפשר. מיד להפעיל לחץ caudal לכיוון rostral עם אור לסחוט מיד מעל הישנים לכיוון האוורור באמצעות micropipetter עם קצה, בזהירות לאסוף את הזרע כפי שהוא סחוט מן הזכר במרווחים 50 מיקרוליטר.
הוסף aliquot של זרע ישירות על 500 מיקרוליטר כרכים של פתרון מאריך זרע על קרח. מיד לאחר האיסוף, מניחים דגים במים מתוקים המטופלים על ידי מעיל רפש. עבור B.gauderio ביצה איסוף, לאחר ייבוש דג נקבה B.gauderio הרדמה, מיד מניחים את הדג על צידו עם הראש מול היד הלא דומיננטית ולהחיל לחץ caudal כדי rostral כיוון עם אור לסחוט בינוני על הישנים לכיוון האוורור.
באמצעות כלי polytetrafluoroethylene, בזהירות לאסוף את הביצים כפי שהם נסחטים מן cloaca במהירות למקם את הביצים בצלחת פטרי מכוסה קטן. אם עובדים לבד לאחר סחיטה, לגעת במסת הביצה לבסיס של צלחת פטרי קטנה כפי שהם גורשו מן הנקבה. מיד לאחר איסוף הביצים, מניחים את הדגים במים מתוקים שטופלו במעיל רפש.
עבור B.gauderio הפריה חוץ גופית, להוסיף 100 microliters של פתרון SES זרע מעורב היטב ישירות מעל מסת הביצית, ואחריו מיליליטר אחד של מים במערכת טרייה. מערבבים את ההשעיה gametes ביסודיות במשך 30 עד 60 שניות לפני הוספת אחד עד שני מיליליטר נוספים של 0.22 מיקרומטר נקבובית מים מסוננים מערכת לתאים. תייגו את המנה עם זמן ההפריה החוץ גופית והכנסו את המנה לאנקובטור של 29 מעלות צלזיוס, והגדרת טיימר של 50 דקות כדי לבדוק את התקדמות הפיתוח.
במהלך תקופת ההפריה, השתמש טיפ פיפית microloader כדי לטעון בחזרה שני microliters של פתרון ההזרקה של עניין לתוך מחט microinjection ולגרש את הנוזל קרוב לקצה ככל האפשר. כאשר תא בודד נוצר בקוטב החייתי של תא אחד לפחות, להעביר את המנה תחת מיקרוסקופ ניתוח ולהשתמש בזוג מטלפים עדין לשבור את קצה המחט בזווית משופעת לכיוון שבו המתחדד של המחט מתחיל להפגין קשיחות. נשא המחט צריך להישאר קטן ככל האפשר תוך שמירה על התחדדות נוקשה.
זהה את הזיגוטים המתפתחים מתחת למיקרוסקופ ולהשתמש פיפטה העברת פלסטיק עם קצה לחתוך למקם 10 עד 20 ביצים במים מעט ככל האפשר על קצה מגלשת מיקרוסקופ זכוכית להגדיר בחלק העליון ההפוך של צלחת פטרי. באמצעות מחיקת משימה עדינה, לחץ בעדינות על השקופית כדי להסיר את המים העודפים כדי לאפשר לביצים לדבוק בחוזקה בקצה השקופית. מים יהיו מרושעים מתחת למגלשה ולמשוך ביצים על הקצה.
צריך להיות רק מספיק מים כדי לשמור על הביצים לחות תוך שמירה על לחות עומדת קטנה, כדי למנוע תנועת ביצה במהלך ההזרקה. ליישר את הביצים נגד המחוון אנכית, בניצב למחט המתקרבת, ולהשתמש micromanipulator למקם את המחט נגד chorion. לאחר מכן, מחזיק את המחט בזווית של כ 45 מעלות, להכניס את הקצה הראשון לתוך chorion ולאחר מכן, לתוך התא היחיד, הזרקת דרך החלמון אם אפשר.
הסר ביצים שבורות במהלך ההזרקה עם מדפים עדין. כאשר כל הביצים הוזרקו, השתמש בבקבוק להשפריץ של 0.22 מיקרומטר נקבוביות מים מערכת מסוננים כדי לשטוף בעדינות את הביצים בשלב ההזרקה לתוך צלחת פטרי חדשה בקוטר 100 מ"מ. לאחר בחירת RNAs קצרה מוצלחת וסינתזה, ניתן לבדוק את המחשוף במבחנה לבחירה עבור microinjections תא יחיד.
לאחר ניקוי ושכפול PCR, בניסוי מייצג זה, מוטציות הנגרמות על ידי CRISPR-Cas9 זוהו בשיבוטים בודדים של B.gauderio ו- B.brachyistius עם הפחתת משרעת חזקה של פריקת איברים חשמליים, ואילו פקדים לא מזוהים הציגו רק גנוטיפים המוזכרים. הדמיה של משרעת פריקת איברים חשמליים בין מוטציות CRISPR מאושרות לגודל הסוכן תאמה פקדים לא מושתקים הראו כי הן מוטציית SCN-4 AA B.brachyistius והן עוברי B.gauderio היו משרעת פריקת איברים חשמליים נמוכה משמעותית מאשר פקדים. בעת ביצוע זריקות מיקרו, לנוע מהר ובכוונה ככל האפשר כדי למקסם את מספר עוברים חד-תאיים מוזרקים ששורדים.
אין לבזבז זמן עם ביצים קשות. לאחר שזוהו מוטנטים מוצלחים, שיטות רבייה מסורתיות יכולות ליצור קווי מוטנטים יציבים, אשר מבטלים את חששות הפסיפסים הקשורים ל- CRSPR. פרוטוקול זה יאפשר לחוקרים לערוך מחקרים גנומיים השוואתיים עם אימות תפקודי בשני מינים מפותחים של דגים חשמליים חלשים.
