CRISPR/Cas9 gen düzenlemesi zayıf elektrikli balıklarda, özellikle karşılaştırmalı bir bağlamda, araştırmacıların belirli genlerin ve genetik varyansın henotik varyasyona nasıl katkıda bulunacağı konusunda hipotezleri test etmelerini sağlayacaktır. CRISPR/Cas9 mutant F-zero embriyoları üretmek için etkili bir yöntemdir. Bu protokol, araştırmacıların zayıf elektrikli balıkların yakınsavetle evrimleşmiş iki türünde CRISPR-Cas9 manipülasyonları yapmalarına olanak tanır.
Diğer elektrikli balık veya diğer balık türlerinde bazı değişiklikler ile bu yaklaşımı kullanmanın anahtarı sgRNA yapmak için transkripsiyonik veya genomik kaynakların kullanılabilirliğidir. Mikroenjeksiyonları gerçekleştirmek ve hücreleri 2B düzlemiçinde 3Boyutlu bir yerde görselleştirmek zor olabilir. Genel mikroenjeksiyon teknikleri uygulamak için yumurta için küçük bir zebra balığı kolonisi edinin.
Savvas Constantinou ile prosedürü göstermek Jared Thompson, benim laboratuvar bir teknisyen olacak. Uygun üreme koşulları altında ilgi balık türlerinin barınma sonra, gravid görünen dişi balık tanımlayın. B.gauderio'da dişinin sadece havalandırmaya kadar kaudal olan gonadları şişmiş olacak.
B.brachyistius'ta dişiler karınları şişmiş ve derin vücutlu görünürler. Anestezi uygulandıktan sonra, tam karıştırma ile bir PCR tüp dpbs hacmi dört kat yumurtlama ajan ekleyin. Çözüm bulutlu olacak.
Hesaplanan dozu ölçmek için bir pipet kullanın ve 28-gauge 19-25 mililitre uzunluğunda beveled iğne ile donatılmış hassas bir cam şırınga içine çözelti çekmeden önce termoplastik bir parça içine seyreltilmiş ajan dağıtmak. Pürüzsüz bir oranda dorsal gövde kas içine solüsyon enjekte ve iğne çıkarmadan önce iki ila dört saniye oturup sağlar. Sonra, hemen kurtarma için tatlı sistem su içine balık yerleştirin.
B.gauderio sperm toplama için, 24 saat sonra, büyük bir erkek balık seçin ve sedasyon sonra mümkün olduğunca çabuk, iyice balık kuru, özellikle baş ve Vent etrafında. Kurutulmuş balık ventral tarafı yukarı yerleştirin, uygun tutucu sola, mümkün olduğunca masaya paralel olarak baş ile bir MS222 ıslatılmış nemli kağıt havlu kaplı. Hemen kaudal yönde ışık hemen deliğe doğru gonadlar üzerinde sıkma ve bir ucu ile bir mikropipet kullanarak rostral yönde basınç uygulayın, dikkatle 50 mikrolitrelik artışlarla erkek ten sıkılır gibi sperm toplamak.
Buz üzerinde sperm genişletici çözelti500 mikrolitre hacimleri üzerine doğrudan sperm aliquot ekleyin. Toplama hemen sonra, balçık kat koruma ürün arıtılmış tatlı sistem suyu içine balık yerleştirin. B.gauderio yumurta toplama için, bir anestezi B.gauderio dişi balık kuruduktan sonra, hemen başı baskın olmayan ele bakan kendi tarafına balık yerleştirin ve ışık havalandırma doğru gondadlar üzerinde medily sıkma ile rostral yönde kaudal yönde basınç uygulayın.
Bir politetrafloroetilen aracı kullanarak, cloaca'dan sıkılırken yumurtaları dikkatlice toplayın ve yumurtaları hızlı bir şekilde küçük bir kapalı Petri kabına yerleştirin. Sıkma sonra tek başına çalışıyorsanız, onlar dişi den atılır gibi küçük Petri çanak tabanına yumurta kütlesi dokunun. Yumurtaları topladıktan hemen sonra, balığı balçık koruma ürünü arıtılmış tatlı sistem suyuna yerleştirin.
B.gauderio in vitro fertilizasyon için, iyi karışık sperm SES çözeltisi doğrudan yumurta kütlesi üzerine 100 mikrolitre ekleyin, tatlı sistem suyu bir mililitre takip. Hücrelere 0,22 mikrometrelik gözenek filtrelenmiş sistem suyu ek bir ila iki mililitre eklemeden önce 30 ila 60 saniye boyunca gamet süspansiyon iyice karıştırın. Yemeği in vitro fertilizasyon süresiyle etiketleyin ve yemeği 29 derecelik bir kantine yerleştirin ve gelişmenin ilerlemesini kontrol etmek için 50 dakikalık bir zamanlayıcı ayarlayın.
Döllenme süresi boyunca, bir mikroenjeksiyon iğnesine ilgi çeken enjeksiyon çözeltisinin iki mikrolitresini geri yüklemek ve sıvıyı ucuna mümkün olduğunca yakın çıkarmak için bir mikroyükleyici pipet ucu kullanın. En az bir hücrenin hayvan direğinde tek bir hücre oluştuğunda, bir kesme mikroskobu altında çanak aktarın ve iğne konik sertlik göstermeye başlar doğru eğimli bir açıyla iğne ucu kırmak için ince forseps bir çift kullanın. İğnenin deliği sert bir konik korurken mümkün olduğunca küçük kalmalıdır.
Mikroskop altında gelişmekte olan zigotları belirleyin ve petri kabının ters üst kısmında ki cam mikroskop kaydırağının kenarına mümkün olduğunca az suya 10 ila 20 yumurta yerleştirmek için kesik uçlu plastik bir transfer pipetkullanın. Hassas bir görev silme kullanarak, yumurtaların sakaya sıkıca yapışmasını sağlamak için fazla suyu çıkarmak için kaydırağa hafifçe basın. Su kaydırak altında kötü olacak ve kenarına karşı yumurta çekin.
Enjeksiyon sırasında yumurta hareketini önlemek için az ayakta nem korurken yumurta nemli tutmak için yeterli su olmalıdır. Yumurtaları yaklaşan iğneye dik olarak dikey olarak kaydırağa doğru hizala ve iğneyi korrion'a karşı konumlandırmak için bir mikromanipülatör kullanın. Daha sonra, yaklaşık 45 derecelik bir açıyla iğnetutarak, kolion içine ilk ucu takın ve daha sonra, tek bir hücreiçine, mümkünse sarısı ile enjekte.
İnce forceps ile enjeksiyon sırasında herhangi bir kırık yumurta çıkarın. Tüm yumurtalar enjekte edildiğinde, yumurtaları enjeksiyon aşamasından 100 milimetre çapındaki yeni bir Petri kabına yavaşça atmak için 0,22 mikrometrelik gözenek filtrelenmiş sistem suyundan oluşan bir fışkırtma şişesi kullanın. Başarılı bir kısa kılavuz RNA seçimi ve sentezinden sonra, in vitro dekolte tek hücreli mikroenjeksiyonlar için seçim için test edilebilir.
PCR temizliği ve klonlama dan sonra, bu temsili deneyde, CRISPR-Cas9 indüklenen mutasyonlar bireysel B.gauderio ve B.brachyistius klonlar güçlü elektrik organ deşarj genlik azaltma ile tespit edildi, enjekte edilmemiş kontroller ise sadece başvurulan genotipler görüntülenir. Doğrulanmış CRISPR mutantları ile ajan boyutu eşleşen enjekte edilmemiş kontroller arasındaki elektrik organı deşarj genliğini görselleştirmesi, hem SCN-4 AA mutant B.brachyistius hem de B.gauderio embriyolarının kontrollerden önemli ölçüde daha düşük elektrik organı deşarj genliklerine sahip olduğunu göstermiştir. Mikro enjeksiyonları yaparken, hayatta tek hücreli enjekte embriyoların sayısını maksimize etmek için mümkün olduğunca hızlı ve kasıtlı olarak hareket.
Zor yumurtaile zaman kaybetmeyin. Başarılı mutantlar tespit edildikten sonra, geleneksel üreme yöntemleri CRSPR ilişkili mozaik endişeleri ortadan kaldırmak istikrarlı mutant hatları oluşturabilirsiniz. Bu protokol, araştırmacıların, zayıf elektrik balıklarının yakınsazik olarak evrimleşmiş iki türünde fonksiyonel doğrulama ile karşılaştırmalı genomik çalışmalar yapmalarına olanak sağlayacaktır.
