Die CRISPR/Cas9-Genbearbeitung bei schwach elektrischen Fischen, insbesondere in einem vergleichenden Kontext, wird es den Forschern ermöglichen, Hypothesen darüber zu testen, wie spezifische Gene und genetische Varianz zur phänotypischen Variation beitragen. CRISPR/Cas9 ist eine effiziente Methode zur Erzeugung mutierter F-Null-Embryonen. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, CRISPR-Cas9-Manipulationen in zwei konveretierten Arten von schwach elektrischen Fischen durchzuführen.
Der Schlüssel zur Verwendung dieses Ansatzes mit einigen Modifikationen in anderen elektrischen Fischen oder anderen Fischarten ist die Verfügbarkeit von transkriptomischen oder genomischen Ressourcen, um sgRNAs herzustellen. Die Durchführung der Mikroinjektionen und die Visualisierung der Zellen an einer 3D-Position innerhalb einer 2D-Ebene kann schwierig sein. Erhalten Sie eine kleine Zebrafischkolonie für Eier, um allgemeine Mikroinjektionstechniken zu praktizieren.
Das Verfahren mit Savvas Constantinou demonstriert Jared Thompson, ein Techniker aus meinem Labor. Nachdem Sie die von Interesse befindlichen Fischarten unter den entsprechenden Brutbedingungen untergebracht haben, identifizieren Sie weibliche Fische, die gravid erscheinen. In B.gauderio wird das Weibchen geschwollene Gonaden nur kaudal zum Schlot haben.
In B.brachyistius werden Weibchen geschwollene Bäuche haben und tiefkörperlich erscheinen. Nach der Anästhesie-Verabreichung, fügen Sie Laichmittel auf das Vierfache des Volumens von DPBS in einem PCR-Rohr mit gründlicher Mischung. Die Lösung wird trüb.
Verwenden Sie eine Pipette, um die berechnete Dosis zu messen und das verdünnte Mittel auf ein Stück Thermoplast zu verteilen, bevor Sie die Lösung in eine Präzisionsglasspritze mit einer abgeschrägten Nadel mit einer Länge von 28 bis 25 Millilitern ziehen. Injizieren Sie die Lösung in den dorsalen Rumpfmuskel mit einer glatten Rate und lassen Sie die Nadel für zwei bis vier Sekunden vor der Entfernung sitzen. Dann sofort Fisch in frisches Systemwasser zur Erholung geben.
Für B.gauderio Spermien-Sammlung, nach 24 Stunden, wählen Sie einen großen männlichen Fisch und so schnell wie möglich nach der Sedierung, trocknen Sie den Fisch gründlich, vor allem um den Kopf und Vent. Legen Sie die getrocknete Fisch-Ventralseite nach oben, vordernach links in einem geeigneten Halter, bedeckt mit einem MS222 getränkten feuchten Papiertuch mit dem Kopf so parallel wie möglich zum Tisch. Sofort Druck in der kaudalen bis rostralen Richtung mit Licht, das sich sofort über die Gonaden in Richtung des Entlüftungsschachts quetscht und mit einem Mikropipetter mit einer Spitze vorsichtig das Sperma sammelt, da es vom Männchen in 50-Mikroliter-Schritten gepresst wird.
Fügen Sie Aliquot von Spermien direkt auf 500-Mikroliter-Volumen von Spermien-Extender-Lösung auf Eis. Unmittelbar nach der Sammlung Fisch in Schleimmantelschutz produktbehandeltes Frischsystemwasser geben. Für die B.gauderio-Ei-Sammlung, nach dem Trocknen eines anästhesierten B.gauderio weiblichen Fisches, legen Sie den Fisch sofort auf seine Seite mit dem Kopf zur nicht dominanten Hand und üben Druck in der kaudalen bis rostralen Richtung mit Licht, das sich medial über die Gonaden in Richtung entlüftung drückt.
Mit einem Polytetrafluorethylen-Werkzeug die Eier vorsichtig sammeln, wie sie aus der Kloake gepresst werden, und legen Sie die Eier schnell in eine kleine bedeckte Petrischale. Wenn Sie nach dem Quetschen allein arbeiten, berühren Sie die Eimasse an die Basis der kleinen Petrischale, während sie vom Weibchen vertrieben werden. Unmittelbar nach dem Sammeln der Eier, legen Sie die Fische in Schleim Mantel Schutz Produkt behandelt frischesystem Wasser.
Für die B.gauderio In-vitro-Fertilisation 100 Mikroliter der gut gemischten Spermien-SES-Lösung direkt über die Eimasse geben, gefolgt von einem Milliliter frischer Systemwasser. Mischen Sie die Gametes Suspension gründlich für 30 bis 60 Sekunden, bevor Sie den Zellen ein bis zwei Milliliter 0,22-Mikrometer Porengefiltertes Systemwasser hinzufügen. Beschriften Sie die Schale mit der In-vitro-Fertilisationszeit und legen Sie das Gericht in einen 29-Grad-Grad-Celsius-Inkubator, indem Sie einen 50-Minuten-Timer einstellen, um den Fortschritt der Entwicklung zu überprüfen.
Verwenden Sie während der Düngungszeit eine Mikrolader-Pipettenspitze, um zwei Mikroliter der von Interesse sindden Injektionslösung in eine Mikroinjektionsnadel zu laden und die Flüssigkeit so nah wie möglich an der Spitze zu vertreiben. Wenn sich eine einzelne Zelle am Tierpol von mindestens einer Zelle gebildet hat, übertragen Sie die Schale unter einem Sezierendes Mikroskop und verwenden Sie ein Paar feine Zangen, um die Nadelspitze in einem abgeschrägten Winkel zu brechen, wohin die Verjüngung der Nadel beginnt, Steifigkeit zu zeigen. Die Bohrung der Nadel sollte so klein wie möglich bleiben, während eine starre Verjüngung beibehalten wird.
Identifizieren Sie die sich entwickelnden Zygoten unter dem Mikroskop und verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette mit einer geschnittenen Spitze, um 10 bis 20 Eier in so wenig Wasser wie möglich auf den Rand des Glasmikroskopschlittens zu legen, das in der umgekehrten Oberseite der Petrischale gesetzt ist. Drücken Sie mit einem empfindlichen Aufgabenwischen vorsichtig die Rutsche, um das überschüssige Wasser zu entfernen, damit die Eier fest am Rand der Rutsche haften können. Wasser wird unter der Rutsche böse sein und Eier gegen den Rand ziehen.
Es sollte gerade genug Wasser vorhanden sein, um die Eier feucht zu halten und dabei wenig stehende Feuchtigkeit zu erhalten, um die Eibewegung während der Injektion zu vermeiden. Richten Sie die Eier vertikal, senkrecht zur nahenden Nadel, und positionieren Sie die Nadel mit einem Mikromanipulator gegen den Chorion. Dann, halten Sie die Nadel in einem etwa 45-Grad-Winkel, legen Sie die Spitze zuerst in die Chorion und dann, in die Einzelzelle, injektionen durch das Eigelb, wenn möglich.
Entfernen Sie alle gebrochenen Eier während der Injektion mit feinen Zangen. Wenn alle Eier injiziert wurden, verwenden Sie eine Spritzflasche mit 0,22 Mikrometer Porengefiltertem Systemwasser, um die Eier vorsichtig von der Injektionsstufe in eine neue Petrischale mit 100 MillimeterDurchmesser zu spülen. Nach einer erfolgreichen kurzen Tonrnasauswahl und -synthese kann die In-vitro-Spaltung auf die Auswahl für einzellige Mikroinjektionen getestet werden.
Nach der PCR-Reinigung und dem Klonen wurden in diesem repräsentativen Experiment CRISPR-Cas9-induzierte Mutationen in einzelnen B.gauderio- und B.brachyistius-Klonen mit starker elektrischer Organentladungsamplitudenreduktion identifiziert, während nicht injizierte Kontrollen nur auf Genotypen referenzierten. Die Visualisierung der elektrischen Organentladungsamplitude zwischen bestätigten CRISPR-Mutationen und der nicht injizierten Steuerung abgestimmten Wirkstoffgröße zeigte, dass sowohl SCN-4 AA-Mutanten B.brachyistius als auch B.gauderio-Embryonen deutlich niedrigere elektrische Organentladungsamplituden als Kontrollen hatten. Bewegen Sie sich bei der Durchführung der Mikroinjektionen so schnell und bewusst wie möglich, um die Anzahl der einzellig injizierten Embryonen zu maximieren, die überleben.
Verschwenden Sie keine Zeit mit schwierigen Eiern. Sobald erfolgreiche Mutanten identifiziert wurden, können traditionelle Züchtungsmethoden stabile mutierte Linien erzeugen, die CRSPR-assoziierte Mosaikismus-Bedenken beseitigen. Dieses Protokoll wird es den Forschern ermöglichen, vergleichende genomische Studien mit funktioneller Validierung in zwei konverediziert entwickelten Arten von schwach elektrischen Fischen durchzuführen.
