L'editing genico CRISPR/Cas9 nei pesci debolmente elettrici, in particolare in un contesto comparativo, consentirà ai ricercatori di testare ipotesi su come geni specifici e varianza genetica contribuiscono alla variazione fenotipica. CRISPR/Cas9 è un metodo efficiente per generare embrioni F-zero mutanti. Questo protocollo consente ai ricercatori di condurre manipolazioni CRISPR-Cas9 in due specie convergently evolute di pesci debolmente elettrici.
La chiave per utilizzare questo approccio con alcune modifiche in altri pesci elettrici o altre specie ittiche è la disponibilità di risorse trascrittomiche o genomiche per fare sgRNA. Eseguire le microiniezioni e visualizzare le cellule in una posizione 3D all'interno di un piano 2D può essere difficile. Ottieni una piccola colonia di zebrafish per le uova per praticare tecniche generali di microiniezione.
A dimostrare la procedura con Savvas Constantinou sarà Jared Thompson, un tecnico del mio laboratorio. Dopo aver alloggiato le specie ittiche di interesse nelle condizioni di riproduzione appropriate, identificare i pesci femminili che appaiono gravidi. In B.gauderio, la femmina avrà gonadi gonfi appena caudal allo sfiato.
In B.brachyistius le femmine avranno pance gonfie e appariranno corpose. Dopo la somministrazione di anestesia, aggiungere l'agente di deposizione delle uova a quattro volte il volume di DPBS in un tubo PCR con miscelazione accurata. La soluzione diventerà nuvolosa.
Utilizzare una pipetta per misurare la dose calcolata e erogare l'agente diluito a un pezzo di termoplastica prima di disegnare la soluzione in una siringa di vetro di precisione dotata di un ago smussato di lunghezza da 19 a 25 millilitri calibro. Iniettare la soluzione nel muscolo del tronco dorsale a una velocità regolare e lasciare riposare l'ago per due o quattro secondi prima della rimozione. Quindi, mettere immediatamente il pesce in acqua di sistema fresca per il recupero.
Per la raccolta dello sperma B.gauderio, dopo 24 ore, selezionare un grande pesce maschio e il più rapidamente possibile dopo la sedazione, asciugare accuratamente il pesce, specialmente intorno alla testa e a Vent. Posizionare il lato ventrale del pesce essiccato verso l'alto, anteriore a sinistra in un apposito supporto, coperto da un tovagliolo di carta umido imbevuto di MS222 con la testa il più parallela possibile al tavolo. Applicare immediatamente la pressione nella direzione caudale-rostrale con una leggera spremitura immediatamente sopra le gonadi verso lo sfiato e utilizzando un micropipetter con una punta, raccogliere attentamente lo sperma mentre viene spremuto dal maschio in incrementi di 50 microliter.
Aggiungere l'aliquota dello sperma direttamente sui volumi di 500 microliter di soluzione di estensione dello sperma sul ghiaccio. Subito dopo la raccolta, mettere il pesce nell'acqua del sistema fresco trattata con trattamento con melma. Per la raccolta delle uova B.gauderio, dopo aver asciugato un pesce femmina B.gauderio anestetizzato, posizionare immediatamente il pesce su un lato con la testa rivolta verso la mano non dominante e applicare pressione nella direzione caudale-rostrale con una leggera spremitura mediale sulle gonadi verso lo sfiato.
Utilizzando uno strumento di politetrafluoroetilene, raccogliere attentamente le uova mentre vengono spremute dalla cloaca e posizionare rapidamente le uova in una piccola piastra di Petri coperta. Se lavori da solo dopo aver spremitura, tocca la massa dell'uovo alla base della piccola piastra di Petri mentre vengono espulsi dalla femmina. Immediatamente dopo aver raccolto le uova, mettere il pesce in acqua del sistema fresco trattata con melma.
Per la fecondazione in vitro di B.gauderio, aggiungere 100 microlitri della soluzione SES dello sperma ben miscelata direttamente sulla massa dell'uovo, seguita da un millilitro di acqua dolce del sistema. Mescolare accuratamente le sospensioni dei gameti per 30-60 secondi prima di aggiungere alle cellule un ulteriore da uno a due millilitri di acqua di sistema filtrata con pori da 0,22 micrometri. Etichettare il piatto con il tempo di fecondazione in vitro e posizionare il piatto in un incubatore Celsius di 29 gradi, impostando un timer di 50 minuti per controllare l'avanzamento dello sviluppo.
Durante il periodo di concimazione, utilizzare una punta della pipetta del microloader per scaricare due microlitri della soluzione di iniezione di interesse in un ago di microiniezione ed espellere il liquido il più vicino possibile alla punta. Quando una singola cellula si è formata sul palo animale di almeno una cella, trasferire il piatto al microscopio sezionante e utilizzare un paio di pini fini per rompere la punta dell'ago con un angolo smussato verso il punto in cui il cono dell'ago inizia a dimostrare rigidità. Il foro dell'ago deve rimanere il più piccolo possibile mantenendo una cono rigida.
Identificare gli zigoti in via di sviluppo al microscopio e utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica con una punta tagliata per posizionare da 10 a 20 uova nella massima acqua possibile sul bordo dello scivolo del microscopio di vetro incastonato nella parte superiore rovesciata della piastra di Petri. Utilizzando una delicata salvietta per le attività, premere delicatamente lo scivolo per rimuovere l'acqua in eccesso per consentire alle uova di aderire saldamente al bordo dello scivolo. L'acqua sarà malvagia sotto lo scivolo e tirerà le uova contro il bordo.
Ci dovrebbe essere abbastanza acqua per mantenere le uova umidi mantenendo poca umidità in piedi per evitare il movimento delle uova durante l'iniezione. Allineare le uova contro lo scivolo verticalmente, perpendicolare all'ago in avvicinamento, e utilizzare un micromanipolatore per posizionare l'ago contro il corore. Quindi, tenendo l'ago con un angolo di circa 45 gradi, inserire la punta prima nel corore e poi, nella singola cella, iniettando attraverso il tuorlo, se possibile.
Rimuovere eventuali uova rotte durante l'iniezione con forcette fini. Quando tutte le uova sono state iniettate, utilizzare una bottiglia di squirt di acqua di sistema filtrata a poro di 0,22 micrometri per sciacquare delicatamente le uova dalla fase di iniezione in una nuova piastra di Petri di 100 millimetri di diametro. A seguito di una breve guida di successo RNA selezione e sintesi, la scissione in vitro può essere testata per la selezione per microiniezioni a singola cellula.
Dopo la pulizia e la clonazione della PCR, in questo esperimento rappresentativo, le mutazioni indotte da CRISPR-Cas9 sono state identificate nei singoli cloni B.gauderio e B.brachyistius con una forte riduzione dell'ampiezza della scarica di organi elettrici, mentre i controlli non iniettati mostravano solo genotipi a cui si fa riferimento. La visualizzazione dell'ampiezza di scarica dell'organo elettrico tra mutanti CRISPR confermati e dimensioni dell'agente abbinate ai controlli non iniettati ha dimostrato che sia gli embrioni mutanti SCN-4 AA B.brachyistius che B.gauderio avevano ampiezze di scarica di organi elettrici significativamente inferiori rispetto ai controlli. Quando si eseguono le micro iniezioni, muoversi il più rapidamente e deliberatamente possibile per massimizzare il numero di embrioni iniettati a una cellula che sopravvivono.
Non perdere tempo con uova difficili. Una volta identificati i mutanti di successo, i metodi di riproduzione tradizionali possono creare linee mutanti stabili, che eliminano le preoccupazioni di mosaicismo associate al CRSPR. Questo protocollo consentirà ai ricercatori di condurre studi genomici comparativi con convalida funzionale in due specie conver delicatamente evolute di pesci debolmente elettrici.
