La edición de genes CRISPR/Cas9 en peces débilmente eléctricos, particularmente en un contexto comparativo, permitirá a los investigadores probar hipótesis sobre cómo los genes específicos y la varianza genética contribuyen a la variación fenotípica. CRISPR/Cas9 es un método eficiente para generar embriones mutantes F-cero. Este protocolo permite a los investigadores llevar a cabo manipulaciones CRISPR-Cas9 en dos especies evolucionadas convergentemente de peces débilmente eléctricos.
La clave para utilizar este enfoque con algunas modificaciones en otros peces eléctricos u otras especies de peces es la disponibilidad de recursos transcriptómicos o genómicos para hacer sgRNAs. Realizar las microinyeccións y visualizar las celdas en una ubicación 3D dentro de un plano 2D puede ser difícil. Obtener una pequeña colonia de peces cebra para que los huevos practiquen técnicas generales de microinyección.
Demostrando el procedimiento con Savvas Constantinou estará Jared Thompson, un técnico de mi laboratorio. Después de albergar las especies de peces de interés en las condiciones de cría adecuadas, identifique los peces hembra que aparecen gravid. En B.gauderio, la hembra tendrá gónadas hinchadas a caudal hasta el respiradero.
En B.brachyistius las hembras tendrán vientres hinchados y parecen de cuerpo profundo. Después de la administración de anestesia, agregue el agente de desove a cuatro veces el volumen de DPBS en un tubo de PCR con una mezcla completa. La solución se nublará.
Utilice una pipeta para medir la dosis calculada y dispensar el agente diluido a una pieza de termoplástico antes de extraer la solución en una jeringa de vidrio de precisión equipada con una aguja biselada de 28 calibres de 19 a 25 mililitros de longitud. Inyecte la solución en el músculo dorsal del tronco a una velocidad suave y deje que la aguja se siente durante dos a cuatro segundos antes de la extracción. A continuación, coloque inmediatamente el pescado en agua fresca del sistema para su recuperación.
Para la recolección de espermatozoides B.gauderio, después de 24 horas, seleccione un pez macho grande y lo más rápido posible después de la sedación, secar el pescado a fondo, especialmente alrededor de la cabeza y Vent. Coloque el pescado seco de lado ventral hacia arriba, antes a la izquierda en el soporte adecuado, cubierto en una toalla de papel húmeda empapada MS222 con la cabeza lo más paralela posible con la mesa. Aplicar inmediatamente presión en el caudal en dirección rostral con la luz apretando inmediatamente sobre las gónadas hacia la ventilación y usando un micropipetter con una punta, recoja cuidadosamente el esperma a medida que se exprime del macho en incrementos de 50 microlitros.
Añadir alícuota de espermatozoides directamente en volúmenes de 500 microlitros de solución extensora de esperma en hielo. Inmediatamente después de la recolección, coloque el pescado en agua fresca tratada con el producto de protección de la piel de baba. Para la recolección de huevos B.gauderio, después de secar un pez hembra B.gauderio anestesiado, coloque inmediatamente el pez de lado con la cabeza mirando hacia la mano nonteminante y aplique presión en el caudal a la dirección rostral con ligero exprimido mediamente sobre las gónadas hacia el respiradero.
Usando una herramienta de politetrafluoroetileno, recoja cuidadosamente los huevos a medida que se exprimen de la cloaca y coloque rápidamente los huevos en un pequeño plato de Petri cubierto. Si trabaja solo después de apretar, toque la masa de huevo a la base de la pequeña placa de Petri, ya que son expulsados de la hembra. Inmediatamente después de recoger los huevos, coloque el pescado en agua fresca tratada con el producto de protección de la piel de baba.
Para la fertilización in vitro de B.gauderio, agregue 100 microlitros de la solución SES de espermatozoides bien mezclada directamente sobre la masa del óvulo, seguido de un mililitro de agua fresca del sistema. Mezcla bien la suspensión de los gametos durante 30 a 60 segundos antes de añadir de uno a dos mililitros adicionales de agua filtrada poro de 0,22 micrómetros a las células. Etiquete el plato con el tiempo de fertilización in vitro y coloque el plato en una incubadora de 29 grados Celsius, estableciendo un temporizador de 50 minutos para comprobar el progreso del desarrollo.
Durante el período de fertilización, utilice una punta de pipeta de microcargador para cargar dos microlitros de la solución de inyección de interés en una aguja de microinyección y expulsar el líquido lo más cerca posible de la punta. Cuando una sola célula se haya formado en el polo animal de al menos una célula, transfiera el plato bajo un microscopio diseccionador y use un par de fórceps finos para romper la punta de la aguja en un ángulo biselado hacia donde el cónico de la aguja comienza a demostrar rigidez. El orificio de la aguja debe permanecer lo más pequeño posible mientras se mantiene un cónico rígido.
Identifique los cigotos en desarrollo bajo el microscopio y utilice una pipeta de transferencia de plástico con una punta cortada para colocar de 10 a 20 huevos en la menor agua posible en el borde del portaobjetos del microscopio de vidrio establecido en la parte superior invertida de la placa Petri. Con una delicada toallita de tarea, presione suavemente el portaobjetos para eliminar el exceso de agua para permitir que los huevos se adhieran firmemente al borde del portaobjetos. El agua será perversa bajo el tobogán y tirará de los huevos contra el borde.
Debe haber suficiente agua para mantener los huevos húmedos mientras se mantiene poca humedad de pie para evitar el movimiento del huevo durante la inyección. Alinee los huevos contra el portaobjetos verticalmente, perpendicular a la aguja que se aproxima, y utilice un micromaniprógrafo para colocar la aguja contra la tarea. Luego, sosteniendo la aguja en un ángulo de aproximadamente 45 grados, inserte la punta primero en la tarea y luego, en la sola celda, inyectando a través de la yema si es posible.
Retire los huevos rotos durante la inyección con fórceps finos. Cuando se hayan inyectado todos los huevos, utilice una botella de chorro de agua filtrada del sistema de poro de 0,22 micrómetros para lavar suavemente los huevos de la etapa de inyección en un nuevo plato petri de 100 milímetros de diámetro. Después de una exitosa selección y síntesis de ARN de guía corta, el escote in vitro se puede probar para su selección de microinyeccións de una sola célula.
Después de la limpieza y clonación de PCR, en este experimento representativo, se identificaron mutaciones inducidas por CRISPR-Cas9 en clones individuales de B.gauderio y B.brachyistius con una fuerte reducción de la amplitud de descarga de órganos eléctricos, mientras que los controles no inyectados solo mostraban genotipos de referencia. La visualización de la amplitud de descarga de órganos eléctricos entre los mutantes CRISPR confirmados y el tamaño del agente coincidió con los controles no inyectados demostró que tanto los embriones mutantes SCN-4 AA B.brachyistius como B.gauderio tenían amplitudes de descarga de órganos eléctricos significativamente más bajas que los controles. Al realizar las micro inyecciones, muévase lo más rápido y deliberadamente posible para maximizar el número de embriones inyectados de una sola célula que sobreviven.
No pierda tiempo con huevos difíciles. Una vez identificados los mutantes exitosos, los métodos de reproducción tradicionales pueden crear líneas mutantes estables, que eliminan las preocupaciones de mosaico asociadas al CRSPR. Este protocolo permitirá a los investigadores realizar estudios genómicos comparativos con validación funcional en dos especies evolucionadas convergentemente de peces débilmente eléctricos.
