A edição de genes CRISPR/Cas9 em peixes fracamente elétricos, particularmente em um contexto comparativo, permitirá que os pesquisadores testem hipóteses sobre como genes específicos e variância genética contribuem para a variação fenotípica. CRISPR/Cas9 é um método eficiente para gerar embriões mutantes F-zero. Este protocolo permite que os pesquisadores conduzam manipulações CRISPR-Cas9 em duas espécies convergentemente evoluídas de peixes fracamente elétricos.
A chave para usar essa abordagem com algumas modificações em outros peixes elétricos ou outras espécies de peixes é a disponibilidade de recursos transcriômicos ou genômicos para fazer sgRNAs. Realizar as microinjeções e visualizar as células em um local 3D dentro de um plano 2D pode ser difícil. Obtenha uma pequena colônia de zebrafish para ovos para praticar técnicas gerais de microinjeção.
Demonstrando o procedimento com Savvas Constantinou estará Jared Thompson, um técnico do meu laboratório. Depois de abrigar as espécies de peixes de interesse sob as condições adequadas de reprodução, identifique peixes fêmeas que pareçam gravid. Em B.gauderio, a fêmea terá gônadas inchadas apenas caudal para a ventilação.
Em B.brachyistius as fêmeas terão barrigas inchadas e aparecerão encorpadas. Após a administração da anestesia, adicione o agente de desova a quatro vezes o volume de DPBS em um tubo PCR com mistura completa. A solução ficará nebulosa.
Use uma pipeta para medir a dose calculada e dispense o agente diluído em um pedaço de termoplástico antes de desenhar a solução em uma seringa de vidro de precisão equipada com uma agulha chanfrada de 28 bitolas de 19 a 25 mililitros. Injete a solução no músculo dorsal do tronco a uma taxa suave e deixe a agulha sentar-se por dois a quatro segundos antes da remoção. Em seguida, coloque imediatamente os peixes em água fresca do sistema para recuperação.
Para a coleta de esperma de B.gauderio, após 24 horas, selecione um peixe macho grande e o mais rápido possível após a sedação, seque o peixe completamente, especialmente ao redor da cabeça e vent. Coloque o lado ventral do peixe seco para cima, anterior à esquerda no suporte apropriado, coberto por uma toalha de papel úmido embebida MS222 com a cabeça o mais paralela possível com a mesa. Aplique imediatamente pressão na direção caudal à rostral com a luz apertando imediatamente sobre as gônnas em direção à ventilação e usando uma micropipetter com uma ponta, colete cuidadosamente o esperma enquanto ele é espremido do macho em incrementos de 50 microliteres.
Adicione alíquota de esperma diretamente em volumes de 500 microliter de solução extensora de esperma no gelo. Imediatamente após a coleta, coloque os peixes em água fresca tratada com produtos de proteção de lodo. Para a coleta de ovos B.gauderio, depois de secar um peixe fêmea B.gauderio anestesiado, coloque imediatamente o peixe de lado com a cabeça voltada para a mão nondominante e aplique pressão na direção caudal para rostral com leve apertando medialmente sobre as gônadas em direção à ventilação.
Usando uma ferramenta de politetrafluoroetileno, colete cuidadosamente os ovos à medida que são espremidos da cloaca e coloque rapidamente os ovos em uma pequena placa de Petri coberta. Se trabalhar sozinho depois de apertar, toque a massa de ovos na base da pequena placa de Petri enquanto são expulsos da fêmea. Imediatamente após a coleta dos ovos, coloque o peixe em água fresca tratada com o produto tratado pelo produto.
Para fertilização in vitro B.gaudio, adicione 100 microliters da solução ses de esperma bem misturado diretamente sobre a massa de óvulos, seguido por um mililitro de água fresca do sistema. Misture bem a suspensão dos gametas por 30 a 60 segundos antes de adicionar um adicional de um a dois mililitros de 0,22 micrômetros filtrados água do sistema às células. Rotule o prato com o tempo de fertilização in vitro e coloque o prato em uma incubadora Celsius de 29 graus, estabelecendo um temporizador de 50 minutos para verificar o progresso do desenvolvimento.
Durante o período de fertilização, use uma dica de pipeta de microcarregador para carregar dois microliters da solução de injeção de interesse em uma agulha de microinjeção e expelir o líquido o mais próximo possível da ponta. Quando uma única célula se formar no polo animal de pelo menos uma célula, transfira o prato sob um microscópio dissecando e use um par de fórceps finos para quebrar a ponta da agulha em um ângulo chanfrado em direção onde o afunilador da agulha começa a demonstrar rigidez. O furo da agulha deve permanecer o menor possível, mantendo um taper rígido.
Identifique as zigotes em desenvolvimento sob o microscópio e use uma pipeta de transferência de plástico com uma ponta de corte para colocar 10 a 20 ovos em tão pouca água quanto possível na borda do slide do microscópio de vidro colocado na parte superior invertida da placa de Petri. Usando uma limpeza de tarefa delicada, pressione suavemente o slide para remover o excesso de água para permitir que os ovos aderam firmemente à borda do slide. A água será perversa sob o escorregador e puxará ovos contra a borda.
Deve haver água suficiente para manter os ovos úmidos, mantendo pouca umidade em pé para evitar o movimento dos ovos durante a injeção. Alinhe os ovos contra o slide verticalmente, perpendicular à agulha que se aproxima, e use um micromanipulador para posicionar a agulha contra o acorde. Em seguida, segurando a agulha em um ângulo de aproximadamente 45 graus, insira a ponta primeiro no acorde e, em seguida, na única célula, injetando através da gema, se possível.
Remova todos os ovos quebrados durante a injeção com fórceps finos. Quando todos os ovos forem injetados, use uma garrafa de esguicho de 0,22 micrômetros filtrado água do sistema para lavar suavemente os ovos do estágio de injeção em uma nova placa de Petri de 100 milímetros de diâmetro. Após um guia curto bem sucedido seleção e síntese de RNAs, o decote in vitro pode ser testado para seleção para microinjeções de célula única.
Após a limpeza e clonagem do PCR, neste experimento representativo, foram identificadas mutações induzidas pelo CRISPR-Cas9 em clones b.gauderio e b.brachyistius com forte redução da amplitude de descarga de órgãos elétricos, enquanto os controles não injetados apresentaram apenas genótipos referenciados. A visualização da amplitude de descarga do órgão elétrico entre mutantes CRISPR confirmados e o tamanho do agente coincidiu com controles não injetados demonstraram que tanto os embriões mutantes do CN-4 AA B.braquiistius quanto os embriões B.gauderio tinham amplitudes de descarga de órgãos elétricos significativamente menores do que os controles. Ao realizar as micro injeções, mova-se o mais rápido e deliberadamente possível para maximizar o número de embriões injetados por células únicas que sobrevivem.
Não perca tempo com ovos difíceis. Uma vez identificados mutantes bem sucedidos, métodos tradicionais de reprodução podem criar linhas mutantes estáveis, que eliminam as preocupações do mosaico associado ao CRSPR. Este protocolo permitirá que os pesquisadores realizem estudos genômicos comparativos com validação funcional em duas espécies convergentemente evoluídas de peixes fracamente elétricos.
