גישה ניסויית לבדיקת איתות לפטין בגוף העורק והשפעותיו על השליטה בנשימה

ניתן להשתמש בפרוטוקול שלנו כדי לבחון את ההשפעות הנשימתיות של לפטין על גוף התת-עורקים בבקרת הנשימה ההיקפית של צ'מורפלקס, ותגובות פיזיולוגיות להיפוקסיה. אנחנו יכולים גם להעריך את ההשפעות של אובדן ותפקוד הגוף התרדמה באמצעות denervation כירורגית וכימית transfection אדנווירוס בהתאמה. לפני תחילת ההליך, למדוד את הטמפרטורה בתוך תא פלסתמגרופיה הגוף כולו בהתאמה אישית, ולמדוד את הלחות היחסית של המעבדה.

לאחר מכן, למדוד את משקל הגוף ואת הטמפרטורה רקטלי של העכבר הניסיוני. מניחים את העכבר בתוך התא וממקמים צווארון אוקסימטר סביב הצוואר המגולח של החיה. ואל תאטמו לחלוטין את התא כדי להימנע מדליפת אוויר.

המתן כ- 30 דקות עד שהעכבר יהיה שקט והתא יהיה בנפח קבוע. לפני שמתחילים להקליט את אותות הנשימה ואת רוויית החמצן ההיקפי בנורוקסיה. לאחר 20 דקות של נורמוקסיה, לחשוף את החיה לזרימת גז מעורבת מתמדת של 10% חמצן ו 3% פחמן דו חמצני.

ולהתחיל להקליט את המחזור הראשון של היפוקסיה חריפה באותות הנשימה ורווית חמצן היקפית. במהלך 30 השניות הראשונות של היפוקסיה, פתח את שתי היציאות הצדדיות הקטנות בבסיס התא כדי לאפשר תקעים של גזי המיקס. לאחר 30 השניות הראשונות, סגרו את אחת היציאות הצדדיות הקטנות של התא והמשיכו להקליט בהיפוקסיה מתמדת ב-10% מהשבריר של חמצן מעורר השראה למשך חמש דקות.

בסוף הטיפול בהיפוקסיה, החלף את המקור בזרימה כדי לחשוף מחדש את העכבר לאוויר בחדר ולאפשר לחיה להתאושש בנורמוקסיה לפחות 30 דקות לפני תחילת הניתוח הבא. בסוף הניסוי, חבר מזרק לאחד היציאות הצדדיות הקטנות בבסיס התא והזרק מיליליטר אוויר לחדר לתוך תא הדם כולו שלוש פעמים כדי לכייל את התא. לאחר הסומק השלישי, למדוד את הטמפרטורה בתא עם החיה עדיין בפנים ואת התא עדיין סגור.

לאחר מכן, לפתוח את התא ולמדוד את הטמפרטורה רקטלי של העכבר לפני החזרת החיה לכלוב הבית שלה. עבור denervation כירורגית של עצב הסינוס התת,לנהל משככי כאבים לעכבר הרדמה, ולהסיר את השיער באזור הגחוני של הצוואר. לחטא את העור החשוף עם Betadine ואלכוהול ולהחיל משחה על העיניים של החיה.

לאחר ביצוע חתך קו האמצע, להסיר את רקמות החיבור והשומן כדי לחשוף את bifurcation של העורקים הראשיים הנפוצים ולזהות את העצב ההיפוגלוסל. הרם את עצב ההיפוגלוסל כדי לחשוף את עצב ההברה מיד מתחת ולהשתמש במספריים מיקרו-אביביים כדי לנתח באופן דו-צדדי את עצבי הסינוסים התת-מדר. כאשר הגופות התרדמה נחשפו, בעדינות להשעות microliter אחד של אדנווירוס המתאים בארבעה microliters של מטריצת Matrigel נוזלי על הקרח, לכל צד, ולהחיל חמישה microliters של ההשעיה נגיפית על אזור הגוף התרדמה דו צדדית.

המתן שתיים עד שלוש דקות עד מטריצת Matrigel נוזלי התגבש לפני סגירת החתך עם תפר משי 6-0 וניהול מיליליטר אחד של מלוחים נורמליים תת עורית. לאחר מכן לשכן את העכבר בתא התאוששות עם ניטור עד שיקום עצם החזה לפני החזרת החיה לכלוב הבית שלה. עירוי מתמשך של לפטין מגדיל באופן משמעותי את התגובה האוורור היפוקסי בעכברים רזים C57BL/6 בעוד ניתוח עצבי סינוס התרדמה מבטל את הגידול המושרה לפטין זה.

כצפוי, אין השפעות מזרזות של ניתוח עצבי סינוס התרדמה על תגובת האוורור היפוקסית נצפו בקבוצת הניתוחים המזויפים לאחר עירוי לפטין. אינדוקציה של קולטן לפטין ביטוי isoform ארוך בגופים התרדמה של קולטן לפטין ארוך isoform חסר שמנים db / db עכברים תוצאות עלייה משמעותית בתגובה אוורור היפוקסי. בעוד לאחר transfection עם שליטה LacZ אדנווירוס, אין שינוי הוא ציין.

טכניקות אלה מאפשרות ניתוח של תפקידם של גופים התת-ראשיים בצ'מורפלקס ההיקפי ואת ההשפעות של לפטין על גופים התת-ראשיים בשליטה על הנשימה.