Il nostro protocollo può essere utilizzato per esaminare gli effetti respiratori della leptina sul corpo carotideo nel controllo della respirazione chemoreflex periferica e le risposte fisiologiche all'ipossia. Possiamo anche valutare gli effetti della perdita e del guadagno della funzione corporea carotide usando rispettivamente la denervazione chirurgica e chimica e la trasfezione da adenovirus. Prima di iniziare la procedura, misurare la temperatura all'interno di una camera di plastemagrofia di tutto il corpo su misura e misurare l'umidità relativa del laboratorio.
Quindi, misurare il peso corporeo e la temperatura rettale del mouse sperimentale. Posizionare il mouse all'interno della camera e posizionare un collare ossimetro attorno al collo rasato dell'animale. E assicurati di sigillare completamente la camera per evitare perdite d'aria.
Attendere circa 30 minuti fino a quando il mouse non è silenzioso e la camera è a volume costante. Prima di iniziare a registrare i segnali respiratori e la saturazione periferica dell'ossigeno alla normoxia. Dopo 20 minuti di normoxia, esporre l'animale a un flusso costante di gas misto del 10% di ossigeno e del 3% di anidride carbonica.
E iniziare a registrare il primo ciclo di ipossia acuta nei segnali respiratori e nella saturazione periferica dell'ossigeno. Durante i primi 30 secondi di ipossia, aprire le due piccole porte laterali alla base della camera per consentire l'ingresso dei gas di miscela. Dopo i 30 secondi iniziali, chiudere una delle piccole porte laterali della camera e continuare a registrare a un'ipossia costante al 10% della frazione di ossigeno ispirato per cinque minuti.
Al termine del trattamento con ipossia, cambiare la fonte in flusso per esponirlo all'aria ambiente e consentire all'animale di riprendersi a normoxia per almeno 30 minuti prima di iniziare l'analisi successiva. Alla fine dell'esperimento, collegare una siringa in una delle piccole porte laterali alla base della camera e iniettare un millilitro di aria ambiente nella camera di pletosmografia di sangue intero tre volte per calibrare la camera. Dopo il terzo lavaggio, misurare la temperatura nella camera con l'animale ancora all'interno e la camera ancora chiusa.
Quindi, aprire la camera e misurare la temperatura rettale del topo prima di riportare l'animale nella sua gabbia domestica. Per la denervazione chirurgica del nervo del seno carotideo, somministrare l'analgesia al topo anestetizzato e rimuovere i capelli nella regione ventrale del collo. Disinfettare la pelle esposta con Betadine e alcol e applicare unguento agli occhi dell'animale.
Dopo aver fatto un'incisione della linea mediana, rimuovere i tessuti connettivi e adiposi per esporre la biforcazione delle comuni arterie carotidi e identificare il nervo ipoglossico. Sollevare il nervo ipoglossale per esporre immediatamente sotto il nervo glossofaringeo e utilizzare forbici a micro spring per sezionare bilateralmente i nervi del seno carotideo. Quando i corpi carotide sono stati esposti, sospendere delicatamente un microlitro dell'adenovirus appropriato in quattro microlitri di matrice matrigel liquida sul ghiaccio, per lato, e applicare cinque microlitri della sospensione virale all'area del corpo carotide bilateralmente.
Attendere da due a tre minuti fino a quando la matrice di Matrigel liquida si è solidificata prima di chiudere l'incisione con sutura di seta 6-0 e somministrare un millilitro di normale soluzione salina per via sottocutanea. Quindi ospita il topo in una camera di recupero con monitoraggio fino a reclinamento sternale prima di riportare l'animale nella sua gabbia di casa. L'infusione continua di leptina aumenta significativamente la risposta ventilatoria ipossia nei topi magri C57BL/6 mentre la dissezione nervosa del seno carotide abolisce questo aumento indotto dalla leptina.
Come previsto, nessun effetto attenuante della dissezione nervosa del seno carotideo sulla risposta del ventilatore ipossico si osserva nel gruppo di chirurgia fittizia dopo infusione di leptina. L'induzione dell'espressione isoforma lunga del recettore della leptina nei corpi carotidei dei topi db/db obesi a lungo carenti del recettore della leptina provoca un aumento significativo della risposta ventilatoria ipossia. Mentre dopo la trasfezione con controllo LacZ adenovirus, non si osserva alcun cambiamento.
Queste tecniche consentono di analisi del ruolo dei corpi carotidi nella chemoreflex periferica e degli effetti della leptina sui corpi carotidi nel controllo della respirazione.
