Unser Protokoll kann verwendet werden, um die atmungsseren Wirkung von Leptin auf den Karotiskörper in der peripheren chemoreflex Atemkontrolle und physiologische Reaktionen auf Hypoxie zu untersuchen. Wir können auch die Auswirkungen von Verlust und Gewinn der Karotis-Körperfunktion mit chirurgischer und chemischer Denervation und Adenovirus-Transfektion bewerten. Vor Beginn des Verfahrens, messen Sie die Temperatur in einem maßgeschneiderten Ganzen Körper Plasthemagrophy Kammer, und messen Sie die relative Luftfeuchtigkeit des Labors.
Als nächstes messen Sie das Körpergewicht und die Rektaltemperatur der experimentellen Maus. Legen Sie die Maus in die Kammer und legen Sie einen Oximeterkragen um den rasierten Hals des Tieres. Und achten Sie darauf, die Kammer vollständig zu versiegeln, um Luftlecks zu vermeiden.
Warten Sie ca. 30 Minuten, bis die Maus leise ist und die Kammer ein konstantes Volumen hat. Vor Beginn der Aufzeichnung der Atemsignale und der peripheren Sauerstoffsättigung bei Normoxia. Nach 20 Minuten Normoxia setzen Sie das Tier einem konstanten Mischgasstrom von 10% Sauerstoff und 3% Kohlendioxid aus.
Und beginnen Sie die Aufzeichnung des ersten Zyklus der akuten Hypoxie in Atemsignalen und peripherer Sauerstoffsättigung. Öffnen Sie in den ersten 30 Sekunden der Hypoxie die beiden kleinen Seitenanschlüsse an der Basis der Kammer, um insteckbare Gase zu ermöglichen. Schließen Sie nach den ersten 30 Sekunden einen der kleinen Seitenanschlüsse der Kammer und notieren Sie fünf Minuten lang bei einer konstanten Hypoxie bei 10% des Anteils an inspiriertem Sauerstoff.
Wechseln Sie am Ende der Hypoxie-Behandlung die In-Flow-Quelle, um die Maus wieder der Raumluft auszusetzen, und lassen Sie das Tier sich mindestens 30 Minuten lang bei Normoxia erholen, bevor Sie mit der nächsten Analyse beginnen. Stecken Sie am Ende des Experiments eine Spritze in einen der kleinen Seitenanschlüsse an der Basis der Kammer und injizieren Sie dreimal einen Milliliter Raumluft in die Vollblut-Plethysmographiekammer, um die Kammer zu kalibrieren. Messen Sie nach dem dritten Spülung die Temperatur in der Kammer, wobei sich das Tier noch im Inneren befindet und die Kammer noch geschlossen ist.
Öffnen Sie dann die Kammer und messen Sie die Rektaltemperatur der Maus, bevor Sie das Tier in seinen Heimischenkäfig zurückbringen. Zur chirurgischen Denervation des Karotis Sinusnervs, analgesie an der Anästhesisierungsmaus zu verabreichen und das Haar an der ventralen Stelle des Halses zu entfernen. Desinfizieren Sie die exponierte Haut mit Betadine und Alkohol und tragen Sie Salbe auf die Augen des Tieres auf.
Nach einem Mittellinienschnitt entfernen Sie das Binde- und Fettgewebe, um die Bifurkation der häufigen Karotisarterien zu belichten und den hypoglossalen Nerv zu identifizieren. Heben Sie den hypoglossalen Nerv an, um den Glossopharyngealnerv unmittelbar darunter freizulegen, und verwenden Sie eine Mikrofederschere, um die Karotis-Sinusnerven bilateral zu sezieren. Wenn die Karotiskörper exponiert wurden, hängen Sie vorsichtig einen Mikroliter des entsprechenden Adenovirus in vier Mikroliterflüssig-Matrigel-Matrix auf Eis, pro Seite, und wenden Sie fünf Mikroliter der viralen Suspension auf den Karotiskörperbereich bilateral an.
Warten Sie zwei bis drei Minuten, bis sich die flüssige Matrigelmatrix verfestigt hat, bevor Sie den Schnitt mit 6-0 Seidennaht schließen und einen Milliliter normaler Salinsubkutane verabreichen. Dann hausen Die Maus in einer Erholungskammer mit Überwachung bis zur Brustsanierung, bevor das Tier in seinen Heimischenkäfig zurückgebracht wird. Kontinuierliche Infusion von Leptin erhöht signifikant die hypoxische beatmungstische Reaktion bei mageren C57BL/6-Mäusen, während die Karotis-Sinusnervensektion diese Leptin-induzierte Erhöhung abschafft.
Wie erwartet, werden keine mildernden Wirkungen der Karotis-Sinus-Nervensektion auf die hypoxische beatmungsere Reaktion in der Scheinchirurgie-Gruppe nach Leptin-Infusion beobachtet. Die Induktion der Leptin-Rezeptor-Langisoformexpression in den Karotiskörpern des Leptinrezeptors long isoform deficient adipös-db-Mäuse führt zu einer signifikanten Erhöhung der hypoxischen beatmungseren Reaktion. Während nach der Transfektion mit Kontrolle LacZ adenovirus, keine Veränderung beobachtet wird.
Diese Techniken ermöglichen die Analyse der Rolle von Karotiskörpern im peripheren Chemoreflex und der Auswirkungen von Leptin auf Karotiskörper bei der Kontrolle der Atmung.
