Protokolümüz, periferik chemoreflex solunum kontrolünde leptinin karotis cisim üzerindeki solunum etkilerini ve hipoksiye fizyolojik yanıtları incelemek için kullanılabilir. Ayrıca sırasıyla cerrahi ve kimyasal denervasyon ve adenovirüs transfeksiyonu kullanarak karotis vücut fonksiyonunun kaybı ve kazanım etkilerini değerlendirebiliriz. İşleme başlamadan önce, özel yapılmış bir tüm vücut plasthemagrophy odası içinde sıcaklık ölçmek ve laboratuvar bağıl nem ölçmek.
Daha sonra, deneysel farenin vücut ağırlığını ve rektal sıcaklığını ölçün. Fareyi odanın içine yerleştirin ve hayvanın tıraşlı boynuna bir oksimetre tasması yerleştirin. Ve hava sızıntılarını önlemek için odayı tamamen mühürlediğinden emin olun.
Fare sessiz olana ve oda sabit bir hacimde olana kadar yaklaşık 30 dakika bekleyin. Normoksia solunum sinyalleri ve periferik oksijen doygunluğu kaydetmeye başlamadan önce. Normoksia 20 dakika sonra,% 10 oksijen ve% 3 karbondioksit sabit bir karışık gaz akışına hayvan maruz.
Ve solunum sinyalleri ve periferik oksijen doygunluğu akut hipoksi ilk döngüsü kaydetmeye başlar. Hipoksinin ilk 30 saniyesinde, karıştırma gazlarının fişlerine izin vermek için odanın tabanındaki iki küçük yan bağlantı noktasını açın. İlk 30 saniyeden sonra, odanın küçük yan bağlantı noktalarından birini kapatın ve beş dakika boyunca ilham oksijen fraksiyonunun %10'u kadar sabit bir hipokside kayıt yapmaya devam edin.
Hipoksi tedavisinin sonunda, fareyi oda havasına yeniden maruz bırakmak için akış kaynağını değiştirin ve bir sonraki analize başlamadan önce hayvanın normoksiada en az 30 dakika boyunca iyileşmesine izin verin. Deneyin sonunda, haznenin tabanındaki küçük yan limanlardan birine bir şırınga takın ve odayı kalibre etmek için tüm kan pletismografi odasına üç kez bir mililitre oda havası enjekte edin. Üçüncü floş sonra, hayvan hala içinde ve oda hala kapalı olan oda sıcaklığını ölçün.
Daha sonra, odayı açın ve hayvanı ev kafesine geri döndürmeden önce farenin rektal sıcaklığını ölçün. Karotis sinüs sinircerrahi denervasyon için, anestezi fare analjezi yönetmek, ve boyun ventral bölgede saç kaldırmak. Betadine ve alkol ile maruz kalan cildi dezenfekte ve hayvanın gözlerine merhem uygulayın.
Bir orta hat kesi yaptıktan sonra, ortak karotis arterlerin çatallanma ortaya çıkarmak ve hipoglossal sinir tanımlamak için bağ ve yağ dokuları kaldırmak. Hemen altında glossopharyngeal sinir ortaya çıkarmak için hipoglossal sinir kaldırın ve karotis sinüs sinirleri iki taraflı incelemek için mikro-bahar makas kullanın. Karotis cisimleri maruz kaldığında, yavaşça buz üzerinde sıvı Matrigel matris dört mikrolitre uygun adenovirüs bir mikrolitre askıya, yan başına, ve karotis vücut bölgesine viral süspansiyon beş mikrolitre uygulayın.
Sıvı Matrigel matris6-0 ipek sütür ile kesi kapatma ve normal tuzlu subkutan bir mililitre yönetmeden önce katılaşmış kadar 2-3 dakika bekleyin. Sonra ev kafese hayvan dönmeden önce sternal recumbency kadar izleme ile bir kurtarma odasında fare ev. Aralıklı leptin infüzyonu yağsız C57BL/6 farelerinde hipoksik ventilatör yanıtını önemli ölçüde artırırken karotis sinüs sinirdiseksi bu leptin kaynaklı artışı ortadan kaldırır.
Beklendiği gibi, leptin infüzyonu sonrası sham cerrahi grubunda karotis sinüs sinirdiseksinin hipoksik ventilatör yanıtı üzerine zayıflatıcı etkileri gözlenmez. Leptin reseptörü uzun izoform ekspresyonunun leptin reseptör üydülünün indüksiyonu uzun izoform obez db/db farelerin karotis organlarında hipoksik ventilatör yanıtında önemli bir artışa yol açmaktadır. Kontrol LacZ adenovirüs ile transfeksiyon sonra ise, hiçbir değişiklik gözlenmez.
Bu teknikler, karotis cisimlerinin periferik chemoreflex'teki rolünün ve solunum kontrolünde leptinin karotis cisimler üzerindeki etkilerinin analizini sağlar.
