Nosso protocolo pode ser usado para examinar os efeitos respiratórios da leptina no corpo carótida no controle respiratório chemoreflex periférico, e respostas fisiológicas à hipóxia. Também podemos avaliar os efeitos da perda e do ganho da função corporal carótida usando denervação cirúrgica e química e transfecção de adenovírus, respectivamente. Antes de iniciar o procedimento, meça a temperatura dentro de uma câmara de plasthemagrophy corporal personalizada e meça a umidade relativa do laboratório.
Em seguida, meça o peso corporal e a temperatura retal do rato experimental. Coloque o rato dentro da câmara e coloque uma coleira de oxímetro ao redor do pescoço raspado do animal. E certifique-se de selar completamente a câmara para evitar vazamentos de ar.
Aguarde aproximadamente 30 minutos até que o mouse fique quieto e a câmara esteja em um volume constante. Antes de começar a registrar os sinais respiratórios e a saturação periférica de oxigênio na normoxia. Após 20 minutos de normoxia, exponha o animal a um fluxo constante de gás misto de 10% de oxigênio e 3% de dióxido de carbono.
E começar a registrar o primeiro ciclo de hipóxia aguda em sinais respiratórios e saturação de oxigênio periférico. Durante os primeiros 30 segundos de hipóxia, abra as duas pequenas portas laterais na base da câmara para permitir os plugues dos gases de mistura. Após os 30 segundos iniciais, feche uma das pequenas portas laterais da câmara e continue a registrar em uma hipoxia constante a 10% da fração de oxigênio inspirado por cinco minutos.
No final do tratamento de hipóxia, mude a fonte de fluxo para reexamer o rato para o ar do quarto e permita que o animal se recupere na normoxia por pelo menos 30 minutos antes de iniciar a próxima análise. No final do experimento, conecte uma seringa em uma das pequenas portas laterais na base da câmara e injete um mililitro de ar na câmara de plethysmografia de sangue inteiro três vezes para calibrar a câmara. Após a terceira descarga, meça a temperatura na câmara com o animal ainda dentro e a câmara ainda fechada.
Em seguida, abra a câmara e meça a temperatura retal do rato antes de devolver o animal à gaiola. Para a denervação cirúrgica do nervo sinuso carótida, administre analgesia ao camundongo anestesiado e remova o cabelo na região ventral do pescoço. Desinfete a pele exposta com Betadine e álcool e aplique pomada nos olhos do animal.
Depois de fazer uma incisão midline, remova os tecidos conjuntivos e adiposos para expor a bifurcação das artérias carótidas comuns e identificar o nervo hipoglossal. Levante o nervo hipoglossal para expor o nervo glossofaríngeo imediatamente abaixo e use uma tesoura de micro-mola para dissecar bilateralmente os nervos sinusinos carótidos. Quando os corpos carótidos tiverem sido expostos, suspenda suavemente um microlitra do adenovírus apropriado em quatro microliters de matriz líquida de Matrigel no gelo, de lado, e aplique cinco microlitrais da suspensão viral à área do corpo carótida bilateralmente.
Espere de dois a três minutos até que a matriz de Matrigel líquido se solidifique antes de fechar a incisão com sutura de seda 6-0 e administrar um mililitro de salina normal subcutânea. Em seguida, abriga o rato em uma câmara de recuperação com monitoramento até a recumedência severa antes de devolver o animal para sua gaiola doméstica. A infusão contínua de leptina aumenta significativamente a resposta ventilatória hipóxica em camundongos C57BL/6 magros, enquanto a dissecção do nervo sinusino carótida aboliu esse aumento induzido pela leptina.
Como esperado, nenhum efeito atenuante da dissecção do nervo sinuso carótida na resposta ventilatória hipóxica é observado no grupo de cirurgia falsa após a infusão de leptina. A indução da expressão isoforma longa do receptor de leptina nos corpos carótidos do receptor de leptina longo isoforme obesos deficientes db/db camundongos resulta em um aumento significativo na resposta ventilatória hipóxica. Considerando que após a transfecção com o controle do adenovírus LacZ, nenhuma alteração é observada.
Essas técnicas permitem a análise do papel dos corpos carótidos no chemoreflex periférico e os efeitos da leptina em corpos carótidos no controle das respirações.
