Nuestro protocolo se puede utilizar para examinar los efectos respiratorios de la leptina en el cuerpo carótido en el control respiratorio quimiorrestos periférico, y las respuestas fisiológicas a la hipoxia. También podemos evaluar los efectos de la pérdida y ganancia de la función corporal carótida utilizando la denervación quirúrgica y química y la transfección de adenovirus respectivamente. Antes de comenzar el procedimiento, mida la temperatura dentro de una cámara de plastemagrofia de cuerpo entero hecha a medida, y mida la humedad relativa del laboratorio.
A continuación, mida el peso corporal y la temperatura rectal del ratón experimental. Coloque el ratón dentro de la cámara y coloque un collar oxímetro alrededor del cuello afeitado del animal. Y asegúrese de sellar completamente la cámara para evitar fugas de aire.
Espere aproximadamente 30 minutos hasta que el ratón esté en silencio y la cámara esté a un volumen constante. Antes de comenzar a registrar las señales respiratorias y la saturación periférica de oxígeno en la normoxia. Después de 20 minutos de normoxia, exponga al animal a un flujo de gas mixto constante de 10% de oxígeno y 3%dióxido de carbono.
Y comienza a registrar el primer ciclo de hipoxia aguda en señales respiratorias y saturación periférica de oxígeno. Durante los primeros 30 segundos de hipoxia, abra los dos pequeños puertos laterales en la base de la cámara para permitir el enchufón de los gases de mezcla. Después de los 30 segundos iniciales, cierre uno de los pequeños puertos laterales de la cámara y continúe registrando una hipoxia constante al 10% de la fracción de oxígeno inspirado durante cinco minutos.
Al final del tratamiento con hipoxia, cambie la fuente de flujo para volver a exponer el ratón al aire ambiente y permita que el animal se recupere en la normoxia durante al menos 30 minutos antes de comenzar el siguiente análisis. Al final del experimento, conecte una jeringa en uno de los pequeños puertos laterales en la base de la cámara e inyecte un mililitro de aire de la habitación en toda la cámara de pletimografía de sangre tres veces para calibrar la cámara. Después del tercer lavado, mida la temperatura en la cámara con el animal todavía dentro y la cámara todavía cerrada.
A continuación, abra la cámara y mida la temperatura rectal del ratón antes de devolver el animal a su jaula de origen. Para la denervación quirúrgica del nervio sinusal carótido, administrar analgesia al ratón anestesiado, y eliminar el vello en la región ventral del cuello. Desinfectar la piel expuesta con Betadina y alcohol y aplicar ung ón en los ojos del animal.
Después de hacer una incisión de línea media, retire los tejidos conectivos y adiposos para exponer la bifurcación de las arterias carótidas comunes e identifique el nervio hipoglosal. Levante el nervio hipoglossal para exponer el nervio glosofaríngeo inmediatamente debajo y use tijeras de micro-resortes para diseccionar bilateralmente los nervios del seno carótido. Cuando los cuerpos carótidos hayan sido expuestos, suspenda suavemente un microlitro del adenovirus apropiado en cuatro microlitros de matriz líquida de Matrigel sobre hielo, por lado, y aplique cinco microlitros de la suspensión viral a la zona del cuerpo carótida bilateralmente.
Espere de dos a tres minutos hasta que la matriz líquida de Matrigel se haya solidificado antes de cerrar la incisión con sutura de seda 6-0 y administrar un mililitro de solución salina normal por vía subcutánea. A continuación, albergar el ratón en una cámara de recuperación con supervisión hasta la recumbencia esternal antes de devolver al animal a su jaula de origen. La infusión continua de leptina aumenta significativamente la respuesta ventilatorio hipoxica en ratones magros C57BL/6, mientras que la disección del nervio sinusal carótida abolió este aumento inducido por la leptina.
Como era de esperar, no se observan efectos atenuantes de la disección del nervio sinusal carótido en la respuesta ventilatorio hipoxica en el grupo de cirugía falsa después de la perfusión de leptina. La inducción del receptor de leptina expresión isoforma larga en los cuerpos carótidos de receptor de leptina largo isóleo obeso obeso db/db resulta en un aumento significativo en la respuesta ventilatoria hipoxica. Mientras que después de la transfección con el adenovirus de Control LacZ, no se observa ningún cambio.
Estas técnicas permiten el análisis del papel de los cuerpos carótidos en el chemoreflex periférico y los efectos de la leptina en los cuerpos carótidos en el control de la respiración.
