我々のプロトコルは、末梢ケモレフ呼吸制御における頸動脈の身体に対するレプチンの呼吸効果および低酸素症に対する生理学的応答を調べるために使用することができる。また、外科的および化学的な脱用とアデノウイルストランスフェクションを使用して、頸動脈の身体機能の喪失と利益の影響を評価することもできます。手順を開始する前に、カスタムメイド全身プラステマグロフィーチャンバー内の温度を測定し、実験室の相対湿度を測定します。
次に、実験用マウスの体重および直腸温度を測定する。マウスをチャンバーの中に置き、動物の剃った首の周りにオキシメーターカラーを置きます。そして、完全に空気漏れを避けるためにチャンバーを密封してください。
マウスが静かでチャンバーが一定の音量になるまで約30分待ちます。ノルモキシアで呼吸信号と末梢酸素飽和度を記録し始める前に.ノルモキシアの20分後、動物を10%酸素と3%の二酸化炭素の一定の混合ガス流に曝します。
そして、呼吸信号と末梢酸素飽和における急性低酸素症の最初のサイクルの記録を開始します。低酸素症の最初の30秒間、チャンバーの基部にある2つの小さな側面ポートを開き、混合ガスのプラグインを可能にします。最初の30秒後、チャンバーの小さな側のポートの1つを閉じ、5分間、インスピレーションを受けた酸素の分率の10%で一定の低酸素状態で記録し続けます。
低酸素症治療の終わりに、インフローソースを切り替えてマウスを室内の空気に再び露出させ、動物がノルモキシアで少なくとも30分間回復してから次の分析を開始します。実験の最後に、シリンジをチャンバーの基部にある小さな側ポートの1つに差し込み、1ミリリットルの室内空気を全血プレチスモグラフィーチャンバーに3回注入してチャンバーを較正する。3回目のフラッシュの後、動物がまだ中にあり、チャンバーがまだ閉じている状態でチャンバー内の温度を測定します。
次に、チャンバーを開き、動物を自宅のケージに戻す前に、マウスの直腸温度を測定します。頸動脈洞神経の外科的脱毛のために、麻酔マウスに鎮痛を投与し、首の腹側領域で毛髪を除去する。露出した皮膚をベタジンとアルコールで消毒し、動物の目に軟膏を塗布する。
中線切開を行った後、結合組織と脂肪組織を取り除き、一般的な頸動脈の分岐を露出させ、舌下神経を同定する。舌下神経を持ち上げてすぐ下の舌咽頭神経を露出させ、マイクロスプリングハサミを使って頸動脈洞神経を二国間で解剖する。頸動脈体が露出したら、適切なアデノウイルスの1マイクロリットルを氷上の4マイクロリットルの液体マトリゲルマトリックスにそっと懸濁し、ウイルス懸濁液の5マイクロリットルを頸動脈体領域に両側に塗布する。
液体マトリゲルマトリックスが固まるまで2〜3分待ってから、6-0シルク縫合糸で切開を閉じ、皮下に正常な生理食塩水を1ミリリットル投与する。その後、動物を自宅のケージに戻す前に、胸骨の債務まで監視して回復室にマウスを収容します。レプチンの連続注入は、赤身C57BL/6マウスにおける低酸素換気応答を有意に増加させ、頚動脈洞神経解剖はこのレプチン誘発増加を廃止する。
予想通り、レプチン注入後の恥手術群では、低酸素換気反応に対する頸動脈洞神経解離の減衰効果は認められない。レプチン受容体の長いイソフォームの体におけるレプチン受容体の長いイソフォーム発現の誘導は、肥満db/dbマウスの酸素欠損性の低下の結果、低酸素換気応答の有意な増加をもたらす。一方、コントロールLacZアデノウイルスでトランスフェクションした後、変化は認められない。
これらの技術は、末梢ケモレフにおける頸動脈体の役割と呼吸制御における頸動脈体へのレプチンの影響を分析することを可能にする。
