ייצור פלזמה אוטולוגית עשירה בטסיות דם להגברת הרחבת פיברובלסטים אנושיים במבחנה

Summary

פרוטוקול זה מציג מכשיר המייצר PRP כדי להגביר את ההתרחבות במבחנה של תאים במערכת תרבית פיברובלסטים אוטולוגית 100%.

Abstract

כיום יש עניין קליני רב בשימוש בפיברובלסטים אוטולוגיים לתיקון העור. ברוב המקרים נדרשת תרבית תאי עור במבחנה. עם זאת, לתרבית תאים באמצעות מדיה של תרבית קסנוגנית או אלוגנית יש כמה חסרונות (כלומר, סיכון להעברת חומרים זיהומיים או התפשטות תאים איטית). כאן, מערכת תרבית אוטולוגית מפותחת להרחבת תאי פיברובלסטים בעור אנושי במבחנה באמצעות פלזמה עשירה בטסיות דם (PRP) של המטופל עצמו. פיברובלסטים עוריים אנושיים מבודדים מהמטופל בזמן שהם עוברים ניתוח בטן. התרביות נמצאות במעקב עד 7 ימים באמצעות מדיום בתוספת סרום בקר עוברי (FBS) או PRP. תכולת תאי הדם בתכשירי PRP, שגשוג והתמיינות פיברובלסטים מוערכים. פרוטוקול זה מתאר את השיטה לקבלת תכשיר סטנדרטי ולא מופעל של PRP באמצעות מכשיר רפואי ייעודי. התכשיר דורש רק מכשיר רפואי (CuteCell-PRP) וצנטריפוגה. מכשיר זה מתאים בתנאי פרקטיקה רפואיים מספיקים והוא מערכת סגורה חד-שלבית, אפירוגנית וסטרילית הדורשת צנטריפוגת ספין אחת רכה של 1,500 x גרם למשך 5 דקות. לאחר הצנטריפוגה, מרכיבי הדם מופרדים, ואת פלזמה עשירה טסיות נאסף בקלות. מכשיר זה מאפשר הכנה מהירה, עקבית ומתוקננת של PRP שיכול לשמש כתוסף תרבית תאים להרחבת תאים במבחנה של תאים אנושיים. ה- PRP המתקבל כאן מכיל ריכוז טסיות פי 1.5 בהשוואה לדם שלם יחד, עם הסרה מועדפת של תאי דם אדומים ולבנים. נראה כי PRP מציג השפעה מגבירה בהתפשטות תאים בהשוואה ל- FBS (פי 7.7) וכי פיברובלסטים מופעלים בטיפול PRP.

Introduction

רפואה רגנרטיבית שואפת לרפא או להחליף רקמות ואיברים שניזוקו על ידי גיל, מחלה או טראומה, כמו גם לתקן פגמים מולדים. בטיפול אוטולוגי, תאים או רקמות נסוגים מהמטופל, מורחבים או משתנים, ואז מוצגים מחדש לתורם. לצורה זו של טיפולים יש פוטנציאל רחב בתחום הדרמטולוגיה¹. בטיפול אוטולוגי בפיברובלסטים, הפיברובלסטים של המטופל מתורבתים ומוזרקים מחדש לטיפול בקמטים, קמטוטים או צלקות אקנה. מכיוון שפיברובלסטים הם התאים הפונקציונליים העיקריים בדרמיס, הזרקה של פיברובלסטים אוטולוגיים עשויה להיות מועילה יותר מטיפולים אחרים בהצערת הפנים².

בעור, פיברובלסטים אחראים לסינתזה ולהפרשה של חלבונים חוץ-תאיים (כלומר קולגן, אלסטין, חומצה היאלורונית וגליקוזאמינוגליקנים). הם גם משחררים גורמי גדילה המווסתים את תפקוד התא, נדידה ואינטראקציות בין מטריצת תאים/תאים בהומאוסטזיס עור רגיל ובריפוי פצעים³. פיברובלסטים עוריים כבר הוצגו כטיפול תאי קליני פוטנציאלי לריפוי פצעי עור⁴, התחדשות רקמות⁵, או מילוי עורי בהליכים אסתטיים ופלסטיים⁶. מחקרים מסוימים אף מצביעים על כך שבהקשר של רפואה רגנרטיבית, פיברובלסטים עשויים להיות טיפול תאי מעשי ויעיל יותר מאשר תאי גזע מזנכימליים⁷.

כדי להשיג מספר מספיק של פיברובלסטים ליישומים קליניים, הרחבת תאים היא בדרך כלל חובה. תרבית תאי Ex vivo/in vitro דורשת תווך בסיסי בתוספת גורמי גדילה, חלבונים ואנזימים לתמיכה בהידבקות ובשגשוג תאים. סרום בקר עוברי (FBS) הוא תוסף נפוץ לתרבית תאים, מכיוון שדם העובר 1) עשיר בגורמי גדילה בהשוואה לדם בוגר 2) מציג תכולת נוגדנים נמוכה⁸. ככל שהטיפול התאי מתקדם, ישנם חששות לגבי הבטיחות של תנאי תרבית תאים קלאסיים שבהם FBS מתווסף למדיום התרבית. יתר על כן, יש כיום נטייה להחליף את FBS בחלופות⁹. מספר תחליפים של FBS הראו תוצאות מבטיחות¹⁰.

חלופת הפלזמה העשירה בטסיות דם (PRP) נבחרה כאן, ופיתחנו מכשיר רפואי לייצור תכשיר סטנדרטי של PRP, בשם CuteCell-PRP. השימוש המיועד במכשיר זה הוא הכנת PRP אוטולוגי שישמש כתוסף מדיה לתרבית להרחבת תאים אוטולוגיים בתנאי GMP.

PRP מוגדר כתרחיף טסיות מרוכז בפלזמה. מכיוון שישנם פרוטוקולי הכנה רבים, הנבדלים זה מזה ב-1) כמות הדם הדרושה, 2) סוגי המכשירים שבהם נעשה שימוש, ו-3) פרוטוקול צנטריפוגה, ריכוזי טסיות הדם המתקבלים משתנים מעט מעל ליותר מפי 10 מערך הבסיס של הדם. בנוסף, תכשירי PRP מכילים רמות משתנות של זיהום תאי דם אדומים ולבנים. המינוח "PRP" משמש אפוא לתיאור מוצרים השונים מאוד בהרכבם הביולוגי ובהשפעות הטיפוליות האפשריות שלהם.

ברוב המחקרים, החלפת FBS מושגת באמצעות ריכוזים שונים של PRP המופעל (על ידי טרומבין או סידן). הפעלה מלאכותית זו מעוררת שחרור מיידי וחשוב של גורמי גדילה טסיות מ 15 דקות עד 24 שעות¹¹. לכן, הוא האמין כי הפעלת טסיות אינו רצוי עבור יישומים בתרביות תאים, שבו שחרור איטי של גורמי גדילה מ degranulation טסיות הדרגתי נדרש.

טיפול PRP כרוך בהכנת טסיות דם אוטולוגיות בפלזמה מרוכזת¹². ריכוז הטסיות האופטימלי אינו ברור, ומגוון רחב של מכשירים מסחריים זמינים להכנת PRP¹³. חוסר סטנדרטיזציה זה נובע מחוסר עקביות בין מחקרים והוביל לקופסה שחורה לגבי מינון ועיתוי ההזרקה. פרוטוקול זה מתאר הליך להשגת PRP אוטולוגי באמצעות מכשיר PRP ייעודי זה להרחבת פיברובלסטים בעור במודל תרבית אקס ויו אוטולוגי 100%.