אנו מספקים כאן פרוטוקול מפורט להערכת המאפיינים המתגמלים או המעוררים של הגירוי הגנטי של אזור מוח מסוים. הטכניקה יכולה לענות במהירות אם גירוי של תאים ספציפיים הוא מתגמל או משכנע. אנו מתארים התקנה לגירוי אזור הטגמנטל הגחוני, אך ניתן להתאים בקלות את הפרוטוקולים שלנו לשינוי פרמטרים ספציפיים במונחים של אזורים שונים שנחקרו.
כדי להתחיל, השתמש במיקרו-בקרים חד-לוחיים כדי לשלוט במקור הלייזר. טען את קובץ ה- Script בלוח המיקרו-בקרים באמצעות כבל החיבור המתאים למחשב. הסקריפט כולל אפנון חיצוני המגיע מתופסת המעקב באמצעות תיבת TTL, ופלט ללייזר כדי לשלוט בפרמטרי גירוי.
השתמש בכבל רשת כדי לחבר את תיבת ה- TTL ללוח. ודא שהלייזר מוגדר לשליטה באמצעות אפנון חיצוני וחבר את הלייזר ללוח באמצעות כבל FC/PC. חבר את הפינים המתאימים לחלקי הקרקע של הלוח.
כדי לחבר את מקור הלייזר לסיבים האופטיים, חבר תחילה את מקור הלייזר למפרק סיבובי. חבר כבל טלאי למפרק הסיבובי. לייצב את המפרק הסיבובי מעל המנגנון, אבל מחוץ לאזור ההקלטה.
ודא את אורך כבל תיקון סיבים אופטיים מתאים כדי לאפשר לעכבר לנוע ללא קשיים בזירה. כדי לכייל את הגדרת הזירה, השתמש בסרגל כדי למדוד חלק מסוים של המנגנון הפיזי. בתוכנה, צייר קו התואם לחלק הנמדד.
תחת הכרטיסיה צייר קנה מידה לכיול, הזן את הערך שכבר ידוע. לעצב את הזירה, לצייר את האזור שבו התנועה של העכברים תירשם. צור את האזורים, צייר את האזורים שבסופו של דבר יוקצו כזוג לייזר, לא משויך בלייזר וניטרלי.
לחץ על לחצן אמת התקנה כדי לאמת את ההתקנה כדי לאשר שאין פרמטרים מתנגשים, לדוגמה, אזורים מחוץ לזירה. ודא שבקרת החומרה זמינה והגדר את זמן הניסוי ל- 30 דקות, לאפשרות til חוזרת בהגדרות תיבת הייחוס. הקצה תא כזוג לייזר, שבו הכניסה של העכבר יפעיל אות TTL באמצעות תוכנת המעקב ללוח מיקרו-בקר תחת הגדרות התנאי.
כדי לשנות את ההגדרה עבור גישת העדפת התא הניטרלי, לאחר הגדרת זירה ושעה, הקצה הן אזורי A והן אזורי B כזוג לייזר על-ידי הוספה כאשר נקודת המרכז נמצאת בכל אזור A ושורה ב' עבור תיבת התנאי הקשורה להגדרות עבור תאי A ו- B. כדי להגדיר את הגדרות הזיהוי, השתמש בדמה כדי להידמות לעכבר. מניחים את הבובה בתא אחד של המנגנון, ולהשתמש בהתקנה אוטומטית עם חיסור דינמי.
מוציאים את הבובה ומ מניחים אותה בתא הנגדי. ודא שהדמה מזוהה במלואה. מניחים את הבובה בתא לייזר מזווג.
כדי לבדוק אם הגירוי עובד, התחל רכישה באמצעות הגדרות בקרת הניסיון שהוגדרו בעבר ולראות אם הגירוי מופעל כפי שהוא צריך. לאחר מכן מניחים את הבובה בתא הלא מפורש או הניטרלי, ולראות אם הגירוי נעצר. השתמש בכוח בלייזר כדי להגדיר את כוח הלייזר ל-10 מילי-וואט.
חבר את שתל הסיבים האופטיים לחבל התיקון הסיבי האופטי באמצעות שרוול קרמי, והצב את העכבר בתא הניטרלי של מנגנון שלושת התאים. המתן עד שהתוכנה תזהה את העכבר. הסר את דלתות ההזזה האנכיות המגבילות את החיה מלהיכנס לתאים הראשיים.
אפשרו לחיה לחקור בחופשיות ללא הפרעות. כל ניסוי העדפת המקום בזמן אמת מתקיים לאורך שמונה מפגשים. עכברי DAT-Cre שהוזרקו עם וירוס AAV channelrhodopsin EYFP באזור tegmental הגחוני נבדקו כדי למקד נוירונים דופאמין.
העכברים בילו בממוצע כ-70% זמנו בתא עם זיווג לייזר, לעומת התא הלא משויך ב-20% והתא הניטרלי ב-10% פנוטיפ התנהגותי מנוגד נצפה עם עכברי Vglut2-Cre שהוזרקו עם AAV channelrhodopsin EYFP באזור הטגמנטל הגחוני. העכברים נמנעו מהתא שהוצמד לגירוי, ובילו זמן רב יותר בבלתי רצויים. במהלך התגובות המותנות בימים 5 ו-8, העכברים לא הראו הימנעות ברורה מהתא שזוג קודם לכן.
כדי להדגים עוד יותר את התפקיד המתגמל או המייב של נוירונים ספציפיים, ניתן להחמיא לשיטה המתוארת בשיטות אחרות כגון פרדיגמות אופרון, או תת-גירוי פוטוגנטי. שים לב בעת טיפול בווירוסים וכאשר אתה משתמש במקורות לייזר.
