Этот метод прерывает лимфатический поток с минимальным повреждением лимфатических эндотелиальных клеток, и с точным контролем времени блокады, он может быть использован для изучения того, как лимфатический поток влияет на гомеостаз и иммунные реакции в лимфатическом узле. Помочь продемонстрировать процедуру будет Цзиньгна Сюэ, аспирант моей лаборатории. Для подготовки инъекционного аппарата вырежьте около 30 сантиметров полиэтиленовых труб.
Подключите кончик иглы А к одному концу трубки. Аккуратно выбить другую иглу и соединить сломанную сторону с другим концом полиэтиленовой трубки. Затем прикрепите иглу А к одноми миллилитровому трубчатому шприцу.
Непосредственно перед использованием, подготовить 10:1 кетамин-ксилазин смеси в солевой раствор. После анестезии мыши путем введения 250 микролитров кетамина / ксилазина смеси инстраперитонически, обеспечить полную анестезию с щепоткой ноша. Бритье меха вокруг ног с ножницами для волос, а затем применить крем для депиляатора вокруг ноги.
Через пять минут протрите остаточный мех и крем для депиля с помощью влажной ткани, затем очистите ногу стерильной водой. Спрей 70% этанола вокруг ноги, чтобы стерилизовать операционную площадь. Поместите мышь в положение, подверженную, и использовать хирургическую ленту, чтобы разоблачить область операции на правой ноге.
Внутридермально вводят пять микролитров 1%Эванс синий краситель, или девять сантиметров жидкости из инъекционного аппарата трубки в правой ноге площадку мыши. Аккуратно массируйте подножку, чтобы помочь жидкости войти в лимфатические сосуды. Под рассеченным микроскопом найдите место разреза в пяти миллиметрах от нижней кромки поплитальной ямки.
Используя ножницы, сделайте небольшой разрез длиной около пяти миллиметров. Затем используйте тонкие типсы операции, чтобы растянуть разрез и подвергать сбора лимфатических сосудов. Определите оба афферентных лимфатических сосудов, ведущих к popliteal лимфатических узлов.
Используя держатель иглы, осторожно вставьте швовую иглу между афферентными лимфатическими сосудами и сафеновой артерией. Аккуратно вытащите иглу вокруг афферентных лимфатических сосудов. Аккуратно потяните шовную веревку, оставив позади около двух сантиметров шовной струны.
Используйте держатель иглы, чтобы помочь связать узел хирурга. Аккуратно массируйте подножку для ног, чтобы не Эванс синий краситель проходит шов сайт, а затем сократить избыток строки с ножницами. Шов других афферентных лимфатических сосудов, а затем закрыть разрез кожи с тем же швом, который был использован для лимфатических сосудов.
Для фиктивного контроля, внутридермально ввести пять микролитров 1%Evans синий краситель в левой ноге площадку, и массаж ноги площадку. Откройте кожу разрезом, а затем закройте рану, не завяв сосуд. При мониторинге мыши после операции, правая нога должна показать отек, с Эванс синий краситель распространяется на бедро, в то время как контрольная нога покажет Эванс синий краситель ограничивается ноги площадку.
Сразу после операции внутридермально вводят 10 микролитров 2%FITC как в правой ноге, так и в левой. Два, шесть и 12 часов после инъекции FITC, собирать popliteal лимфатических узлов из ямы усыпанных мышей. Тщательно удалите перинодальную жировую ткань вокруг pLNs.
Вставлять pLNs в оптимальной резки температурного соединения с медуллярной области пазухи лицом к стороне крио формы. Используйте криотом для подготовки 20-микрон замороженных секций. Чтобы определить распределение FITC в pLNs, изображение крио-разделов под конфокалятивным микроскопом.
Конфокальные изображения, сделанные через два, шесть и 12 часов после инъекции FITC, показывают существенное снижение накопления FITC в поплитальных лимфатических узлах после за швов на афферентные лимфатические сосуды. Остаточный FITC в pLNs был преференциарен аккумулирован в пазухах лимфатических узлов. Конфокальные изображения перинодальной жировой ткани показывают, когда лимфатические сосуды блокируются швами, FITC попадает в ткань, когда лимфатические узлы пазухи, но это не эффективно распределены по лимфатическим узлам.
При попытке этого метода, важно помнить, что вставка шва иглы между кровеносным сосудом и лимфатическим сосудом имеет решающее значение. Неудача этого шага может сломать сосуды. После выполнения этого метода, можно иммунизации мышей с инфекцией или другой иммунной стимуляции для изучения того, как лимфатический поток регулирует иммунную защиту.
Функция лимфатического потока не очень хорошо понимается. Этот метод может быть использован для изучения миграции клеток в лимфатическом узле при отсутствии лимфатического потока.
