Cette méthode interrompt le flux lymphatique avec un minimum de dommages aux cellules endothéliales lymphatiques, et avec un contrôle précis du moment du blocus, il peut être utilisé pour étudier comment le flux lymphatique affecte l’homéostasie et les réponses immunitaires dans le ganglion lymphatique. Jingna Xue, étudiante diplômée de mon laboratoire, aidera à démontrer la procédure. Pour préparer un appareil d’injection, couper environ 30 centimètres de tube de polyéthylène.
Connectez la pointe de l’aiguille A à une extrémité du tube. Déloger soigneusement une autre aiguille et relier le côté cassé à l’autre extrémité du tube de polyéthylène. Fixez ensuite l’aiguille A à une seringue à tuberculine d’un millilitre.
Immédiatement avant l’utilisation, préparer un mélange kétamine-xylazine 10:1 en solution saline. Après anesthésier la souris en injectant 250 microlitres du mélange kétamine/xylazine intraperitoneally, assurer l’anesthésie complète avec une pincée d’orteil. Raser la fourrure autour des jambes avec des tondeuses à cheveux, puis appliquer de la crème depilatory autour de la jambe.
Après cinq minutes, essuyer la fourrure résiduelle et la crème depilatory à l’aide d’un tissu humide, puis nettoyer la jambe avec de l’eau stérile. Vaporiser 70% d’éthanol autour de la jambe pour stériliser la zone d’opération. Placez la souris dans une position couchée, et utilisez du ruban chirurgical pour exposer la zone d’opération sur la jambe droite.
Intradermally injecter cinq microlitres de 1%Evans colorant bleu, ou neuf centimètres du fluide de l’appareil d’injection tube dans le coussin du pied droit de la souris. Masser doucement le pavé pour aider le fluide à pénétrer dans les vaisseaux lymphatiques. Sous un microscope disséquant, localiser un site d’incision à cinq millimètres du bord inférieur de la fossa popliteal.
À l’aide d’une paire de ciseaux, faire une petite incision d’environ cinq millimètres de longueur. Ensuite, utilisez des forceps d’opération fine pour étirer l’incision et exposer les vaisseaux lymphatiques de collecte. Identifier les deux vaisseaux lymphatiques afferents menant aux ganglions lymphatiques popliteal.
À l’aide d’un porte-aiguille, insérez prudemment l’aiguille de suture entre les vaisseaux lymphatiques afferents et l’artère saphenous. Tirez doucement l’aiguille autour des vaisseaux lymphatiques afferents. Tirez soigneusement la corde de suture, en laissant environ deux centimètres de la corde de suture derrière.
Utilisez le porte-aiguille pour aider à attacher le nœud d’un chirurgien. Masser doucement le coussin pour les pieds pour s’assurer qu’aucun colorant bleu Evans ne passe devant le site de suture, puis coupez l’excédent de ficelle avec des ciseaux. Suture les autres vaisseaux lymphatiques afferents, puis fermer l’incision cutanée avec la même suture qui a été utilisé pour les vaisseaux lymphatiques.
Pour le contrôle factice, intradermally injecter cinq microlitres de 1%Evans colorant bleu dans le coussin du pied gauche, et masser le coussin pour les pieds. Ouvrez la peau avec une incision, puis fermez la plaie sans suturing le navire. Lors de la surveillance de la souris après la chirurgie, la jambe droite devrait montrer l’oedème, avec evans colorant bleu s’étendant à la cuisse, tandis que la jambe de contrôle montrera Evans colorant bleu limité à la garniture du pied.
Immédiatement après la chirurgie, injectez intradermally 10 microlitres de 2%FITC dans le coussin droit de pied et la gauche. Deux, six et 12 heures après l’injection de FITC, recueillent les ganglions lymphatiques popliteal des fossa des souris euthanasiées. Retirez soigneusement le tissu adipeux périodal autour des pLN.
Intégrer les pLN dans le composé optimal de température de coupe avec la zone médullaire de sinus faisant face au côté du moule de cryo. Utilisez un cryotome pour préparer des sections congelées de 20 microns. Pour déterminer la distribution du FITC dans les pLN, imagez les cryo-sections sous un microscope confocal.
Les images confocales capturées deux, six et 12 heures après injection de FITC montrent l’accumulation sensiblement réduite de FITC dans les ganglions lymphatiques popliteal après avoir suturing les vaisseaux lymphatiques afferents. Le FITC résiduel dans les pLNs a été préférentiellement accumulé dans les sinus de ganglion lymphatique. Les images confocales du tissu adipeux périodal montrent quand les vaisseaux lymphatiques sont bloqués par suturing, FITC entre dans le tissu quand les sinus de ganglion lymphatique, mais il n’est pas efficacement distribué dans les ganglions lymphatiques.
Lorsque vous essayez cette méthode, il est important de se rappeler que l’insertion de l’aiguille de suture entre le vaisseau sanguin et le vaisseau lymphatique est essentielle. La défaillance de cette étape peut briser les navires. Après avoir effectué cette méthode, il est possible d’immuniser les souris atteintes d’une infection ou d’une autre stimulation immunitaire pour étudier comment le flux lymphatique régule la protection immunitaire.
La fonction du flux lymphatique n’est pas bien comprise. Cette méthode peut être utilisée pour étudier les migrations cellulaires dans le ganglion lymphatique en l’absence de flux lymphatique.
