이 방법은 림프내막 세포에 최소한의 손상으로 림프 흐름을 방해하고 봉쇄 타이밍을 정밀하게 제어하면 림프 흐름이 림프절의 항상성 및 면역 반응에 미치는 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 절차를 입증하는 데 도움이 Jingna Xue, 내 실험실에서 대학원 생입니다. 사출 장치를 준비하려면 약 30센티미터의 폴리에틸렌 튜브를 잘라냅니다.
바늘 A의 끝을 튜브의 한쪽 끝에 연결합니다. 조심스럽게 다른 바늘을 빼내고 깨진 면을 폴리에틸렌 튜브의 다른 쪽 끝에 연결합니다. 그런 다음 바늘 A를 1 밀리리터 결핵 주사기에 부착합니다.
사용하기 직전에 식염수에 10:1 케타민 자일라진 혼합물을 준비합니다. 케타민/자일라진 혼합물의 250마이크로리터를 인트라바이트로 주입하여 마우스를 마취한 후 발가락 핀치로 완전한 마취를 보장하십시오. 헤어 클리퍼로 다리 주위에 털을 면도한 다음 다리 주위에 탈모 크림을 바르습니다.
5분 후, 촉촉한 티슈를 사용하여 잔류 모피와 탈필 크림을 닦은 다음 멸균물로 다리를 청소하십시오. 수술 부위를 살균하기 위해 다리 주위에 70 %의 에탄올을 스프레이하십시오. 마우스를 경향이 있는 위치에 놓고 수술 용 테이프를 사용하여 오른쪽 다리의 수술 영역을 노출시하십시오.
1%에반스 블루 염료의 5개의 마이크로리터, 또는 마우스의 오른발 패드에 튜브를 주입하는 주입 장치에서 유체의 9센티미터를 주입한다. 유체가 림프용기에 들어갈 수 있도록 풋패드를 부드럽게 마사지합니다. 해부 현미경에서, 포라이트 포사의 하단 가장자리에서 5 밀리미터 절개 부위를 찾습니다.
한 쌍의 가위를 사용하여 길이가 약 5밀리미터에 달하는 작은 절개를 합니다. 그런 다음 절개를 스트레칭하고 수집 림프혈관을 노출시키기 위해 미세 한 조작 집게를 사용합니다. 포라이트 림프절로 이어지는 포퍼런트 림프관을 모두 식별합니다.
바늘 홀더를 사용하여, 조심스럽게 흡개 림프관과 사페누동맥 사이에 봉합사 바늘을 삽입. 포이퍼성 림프관 주위에서 바늘을 부드럽게 당깁니다. 봉합사 끈을 조심스럽게 당겨 봉합사 끈의 약 2센티미터를 뒤로 합니다.
바늘 홀더를 사용하여 외과 의사의 매듭을 묶습니다. 발 패드를 부드럽게 마사지하여 에반스 블루 염료가 봉합사 부위를 통과하지 못하도록 한 다음 가위로 여분의 끈을 자릅니다. 다른 흡혈귀 혈관을 봉합한 다음 림프관에 사용 된 동일한 봉합사로 피부 절개를 닫습니다.
가짜 컨트롤을 위해, 왼쪽 발 패드에 1 %에반스 블루 염료의 5 마이크로 리터를 부수고 발 패드를 마사지하십시오. 절개로 피부를 열고 혈관을 봉합하지 않고 상처를 닫습니다. 수술 후 마우스를 모니터링할 때 오른쪽 다리는 부종을 보여주어야 하며, 에반스 블루 염료가 허벅지로 퍼지고, 컨트롤 다리는 에반스 블루 염료가 발 패드에 제한되는 것을 보여 준다.
수술 직후, 오른발 패드와 왼쪽 에 2%FITC의 10 마이크로리터를 부수시면 10마이크로리터를 주입합니다. FITC 주입 후 2시간, 6시간 및 12시간 후, 안락사된 마우스의 포사로부터 포라이트 림프절을 수집한다. pLN 주위의 perinodal 지방 조직을 조심스럽게 제거합니다.
냉동 금형의 측면을 향한 수질 부비동 영역을 최적의 절삭 온도 화합물에 pLN을 포함. 저온을 사용하여 20미크론 냉동 섹션을 준비하십시오. pLN에서 FITC 분포를 결정하기 위해 공초점 현미경하에서 냉동 고리 섹션을 이미지합니다.
FITC 주입 후 2시간, 6시간, 12시간 후에 포심성 림프절을 봉합한 후 포클레아 림프절의 FITC 축적이 크게 감소했습니다. pLN의 잔류 FITC는 림프절 부비동에서 우선적으로 축적되었다. 림프관이 봉합에 의해 차단될 때 perinodal 지방 조직 의 공초점 이미지는 림프절부동시 조직에 진입하지만 림프절 전체에 효과적으로 분포되지는 않습니다.
이 방법을 시도할 때, 혈관과 림프절 혈관 사이 봉합바늘을 삽입하는 것이 중요하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 단계의 실패는 혈관을 깰 수 있습니다. 이 방법을 수행 한 후, 림프 흐름이 면역 보호를 조절하는 방법을 연구하기 위해 감염 또는 기타 면역 자극으로 마우스를 예방 접종 할 수 있습니다.
림프 흐름의 기능은 잘 이해되지 않습니다. 이 방법은 림프흐름이 없는 림프절에서 세포 이동을 연구하는 데 사용될 수 있다.
