Diese Methode unterbricht den Lymphfluss mit minimalen Schäden an lymphatischen Endothelzellen, und mit präziser Kontrolle des Blockade-Timings kann es verwendet werden, um zu untersuchen, wie sich der Lymphfluss auf die Homöostase und Immunantworten im Lymphknoten auswirkt. Jingna Xue, eine Studentin aus meinem Labor, hilft bei der Demonstration des Verfahrens. Um ein Injektionsgerät vorzubereiten, schneiden Sie etwa 30 Zentimeter Polyethylenschläuche.
Schließen Sie die Nadelspitze A an ein Ende des Schlauches an. Entfernen Sie vorsichtig eine andere Nadel, und verbinden Sie die gebrochene Seite an das andere Ende der Polyethylen-Schläuche. Dann Nadel A an einer Ein-Milliliter-Tuberkulinspritze befestigen.
Unmittelbar vor der Anwendung eine 10:1 Ketamin-Xylazin-Mischung in Saline zubereiten. Nach der Anästhesisierung der Maus durch Injektion von 250 Mikrolitern des Ketamin/Xylazin-Gemischs intraperitoneal, sorgen Sie für eine vollständige Anästhesie mit einer Zehenprise. Rasieren Sie das Fell um die Beine mit Haarschneidern, dann tragen Enthaarungscreme um das Bein.
Nach fünf Minuten das Restfell und die Enthaarungscreme mit einem feuchten Gewebe abwischen und dann das Bein mit sterilem Wasser reinigen. Sprühen Sie 70% Ethanol um das Bein, um den Operationsbereich zu sterilisieren. Platzieren Sie die Maus in einer anfälligen Position, und verwenden Sie chirurgisches Klebeband, um den Operationsbereich auf dem rechten Bein freizulegen.
Intradermally injizieren fünf Mikroliter von 1%Evans blauen Farbstoff, oder neun Zentimeter der Flüssigkeit aus dem Injektionsapparat Schläuche in den rechten Fußpolster der Maus. Massieren Sie das Fußpolster sanft, um der Flüssigkeit zu helfen, in die Lymphgefäße einzudringen. Unter einem Sezieren mikroskop, lokalisieren Sie eine Einschnittstelle fünf Millimeter vom unteren Rand der poplitealen Fossa.
Mit einer Schere, machen Sie einen kleinen Schnitt etwa fünf Millimeter in der Länge. Verwenden Sie dann feine Operationszangen, um den Schnitt zu dehnen und die sammelnden Lymphgefäße freizulegen. Identifizieren Sie beide affekenden Lymphgefäße, die zu den poplitealen Lymphknoten führen.
Mit einem Nadelhalter die Nahtnadel vorsichtig zwischen die affemenden Lymphgefäße und die saftige Arterie einlegen. Ziehen Sie die Nadel vorsichtig um die affemenden Lymphgefäße heraus. Ziehen Sie vorsichtig die Nahtschnur und lassen Sie etwa zwei Zentimeter der Nahtschnur zurück.
Verwenden Sie den Nadelhalter, um den Knoten eines Chirurgen zu binden. Massieren Sie das Fußpolster vorsichtig, um sicherzustellen, dass kein Evans blauer Farbstoff die Nahtstelle passiert, und schneiden Sie dann die überschüssige Schnur mit der Schere. Nähen Sie die anderen affefenden Lymphgefäße, dann schließen Sie den Hautschnitt mit der gleichen Naht, die für die Lymphgefäße verwendet wurde.
Für die Scheinkontrolle, intradermally injizieren fünf Mikroliter von 1%Evans blauen Farbstoff in den linken Fußpolster, und massieren Sie das Fußpolster. Öffnen Sie die Haut mit einem Schnitt, und schließen Sie dann die Wunde, ohne das Gefäß zu nähen. Bei der Überwachung der Maus nach der Operation sollte das rechte Bein Ödem zeigen, wobei Evans blauer Farbstoff sich auf den Oberschenkel ausbreitet, während das Kontrollbein Evans blauen Farbstoff zeigt, der auf das Fußpolster beschränkt ist.
Unmittelbar nach der Operation injizieren Sie intradermally 10 Mikroliter von 2%FITC sowohl im rechten Fußpolster als auch in der linken. Zwei, sechs und 12 Stunden nach der FITC-Injektion sammeln Sie die poplitealen Lymphknoten aus der Fossa von eingeschläferten Mäusen. Entfernen Sie vorsichtig das perinodale Fettgewebe um die pLNs.
Die pLNs in eine optimale Schnitttemperaturverbindung mit dem medullären Sinusbereich zur Seite der Kryoform einbetten. Verwenden Sie ein Kryotome, um 20-Mikron gefrorene Abschnitte vorzubereiten. Um die FITC-Verteilung in den pLNs zu bestimmen, stellen Sie die Kryo-Abschnitte unter einem konfokalen Mikroskop ab.
Konfokale Bilder, die zwei, sechs und 12 Stunden nach der FITC-Injektion aufgenommen wurden, zeigen eine erheblich reduzierte FITC-Akkumulation in den poplitealen Lymphknoten, nachdem sie die affetienten Lymphgefäße genährt haben. Der Rest-FITC in den pLNs wurde bevorzugt in den Lymphknotennebenhöhlen angesammelt. Konfokale Bilder des perinodalen Fettgewebes zeigen, wenn Lymphgefäße durch Naht blockiert werden, FITC tritt in das Gewebe ein, wenn der Lymphknoten versäuftet, aber es ist nicht effektiv über die Lymphknoten verteilt.
Beim Versuch dieser Methode ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass das Einsetzen der Nahtnadel zwischen dem Blutgefäß und dem Lymphgefäß entscheidend ist. Ein Scheitern dieses Schritts kann die Gefäße brechen. Nach der Durchführung dieser Methode ist es möglich, Mäuse mit Infektionen oder anderen Immunstimulationen zu immunisieren, um zu untersuchen, wie Lymphfluss den Immunschutz reguliert.
Die Funktion des Lymphflusses ist nicht gut verstanden. Diese Methode kann verwendet werden, um Zellmigrationen im Lymphknoten in Abwesenheit von Lymphfluss zu untersuchen.
