Bu yöntem lenfatik endotel hücrelerine minimal hasar ile lenf akışını keser, ve abluka zamanlaması kesin kontrolü ile, lenf akışının lenf düğümünde homeostazı ve bağışıklık yanıtlarını nasıl etkilediğini incelemek için kullanılabilir. Prosedürü niçin göstermek için yardımcı Jingna Xue, benim laboratuvar bir yüksek lisans öğrencisi olacaktır. Bir enjeksiyon cihazı hazırlamak için, polietilen boru yaklaşık 30 santimetre kesti.
İğne A'nın ucunu tüpün bir ucuna bağlayın. Dikkatle başka bir iğne çıkarmak ve polietilen boru diğer ucuna kırık tarafı bağlayın. Sonra bir mililitrelik tüberkülin şırınga iğne A takın.
Kullanmadan hemen önce, tuzlu bir 10:1 ketamin-ksilazin karışımı hazırlayın. Ketamin/ksilazin karışımının 250 mikrolitresini intraperitoneal olarak enjekte ederek fareyi anestezi ettikten sonra, ayak ucu tutam ile tam anestezi sağlar. Saç makası ile bacaklar etrafında kürk tıraş, sonra bacak etrafında tüy dökücü krem uygulayın.
Beş dakika sonra, artık kürk ve pilatif krem nemli bir doku kullanarak silin, sonra steril su ile bacak temizleyin. Ameliyat alanını sterilize etmek için bacağın etrafına %70 etanol püskürtün. Fareyi yatkın bir konuma yerleştirin ve ameliyat alanını sağ bacakta ortaya çıkarmak için cerrahi bant kullanın.
Intradermally farenin sağ ayak pedi içine enjeksiyon cihazı tüp sıvının% 1 Evans mavi boya, ya da dokuz santimetre beş mikrolitre enjekte. Sıvılenfatik damarlara girmesine yardımcı olmak için ayak yastığına hafifçe masaj edin. Bir diseksiyon mikroskobu altında, popliteal fossa alt kenarından beş milimetre bir kesi sitesi bulmak.
Bir makas kullanarak, yaklaşık beş milimetre uzunluğunda küçük bir kesi yapın. Sonra kesi germek ve toplama lenfdamarları ortaya çıkarmak için ince operasyon forseps kullanın. Popliteal lenf düğümlerine giden afferent lenfatik damarların her ikisini de tanımlayın.
Bir iğne tutucu kullanarak, ihtiyatlı afferent lenfatik damarlar ve safenöz arter arasında dikiş iğnesi takın. Yavaşça afferent lenfatik damarların etrafında iğne çekin. Dikkatle arkasında dikiş dize yaklaşık iki santimetre bırakarak, dikiş dize çekin.
Bir cerrahın düğüm bağlamak için iğne tutucu kullanın. Yavaşça hiçbir Evans mavi boya dikiş site geçer sağlamak için ayak yastığı masaj, sonra makas ile aşırı dize kesti. Dikiş diğer afferent lenfatik damarlar, daha sonra lenfatik damarlar için kullanılan aynı dikiş ile deri kesi kapatın.
Sham kontrolü için, intradermally sol ayak yastığı% 1 Evans mavi boya beş mikrolitre enjekte ve ayak pedi masaj. Bir kesi ile deri açın ve sonra damar dikiş olmadan yara kapatın. Ameliyat sonrası fareyi izlerken sağ bacakta ödem gösterilmelidir, Evans mavi boya uyluk yayılırken, kontrol bacağında evans mavi boya ayak yastığıile sınırlı olarak gösterilmelidir.
Ameliyattan hemen sonra, intradermally sağ ayak pedi ve sol hem de% 2 FITC 10 mikrolitre enjekte. FITC enjeksiyonundan iki, altı ve 12 saat sonra, ötenazi yapılan farelerin fossasından popliteal lenf düğümlerini toplayın. PLN'lerin etrafındaki perinodal yağ dokusunu dikkatlice çıkarın.
PLN'leri, kriyo kalıbının yan tarafına bakan medüller sinüs alanı ile optimum kesme sıcaklığı bileşiğine gömün. 20 mikron dondurulmuş bölümleri hazırlamak için bir kriyotom kullanın. PLN'lerde FITC dağılımını belirlemek için, konfokal mikroskop altında kriyo-kesitleri görüntüleyin.
Confocal görüntüler iki yakalanan, altı, ve 12 saat FITC enjeksiyonundan sonra afferent lenf damarları dikiş sonra popliteal lenf düğümlerinde FITC birikimi önemli ölçüde azaltılmış göstermektedir. PLN'lerde kalan FITC tercihen lenf nodu sinüslerinde birikmişti. Perinodal yağ dokusunun konfokal görüntüleri lenfdamarları dikiş tarafından bloke edildiğinde göstermek, FITC lenf düğümü sinüsler doku girer, ama etkili lenf düğümleri boyunca dağıtılan değil.
Bu yöntemi denerken, bu kan damarı ve lenfatik damar arasında dikiş iğnesi ekleme kritik olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu adımın başarısız lığı damarları kırabilir. Bu yöntemi yaptıktan sonra, lenf akışının bağışıklık korumasını nasıl düzenlediğini incelemek için fareleri enfeksiyon veya diğer bağışıklık stimülasyonu ile aşılamak mümkündür.
Lenf akışının işlevi iyi anlaşılamamıştır. Bu yöntem lenf akımı yokluğunda lenf düğümünde hücre göçleri çalışmak için kullanılabilir.
