Este método interrompe o fluxo linfático com danos mínimos às células linfáticas e, com o controle preciso do tempo de bloqueio, pode ser usado para estudar como o fluxo linfático impacta a homeostase e as respostas imunológicas no linfonodo. Ajudando a demonstrar o procedimento será Jingna Xue, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para preparar um aparelho de injeção, corte aproximadamente 30 centímetros de tubos de polietileno.
Conecte a ponta da agulha A a uma extremidade da tubulação. Desaloja cuidadosamente outra agulha e conecte o lado quebrado à outra extremidade da tubulação de polietileno. Em seguida, conecte a agulha A a uma seringa de tuberculina de um mililitro.
Imediatamente antes do uso, prepare uma mistura de cetamina-xilazina 10:1 em soro fisiológico. Depois de anestesiar o mouse injetando 250 microliters da mistura cetamina/xilazina intraperitonealmente, certifique-se de anestesia total com uma pitada de dedo do dedo do dedo. Raspe a pele ao redor das pernas com cortadores de cabelo, em seguida, aplique creme depilatório ao redor da perna.
Depois de cinco minutos, limpe a pele residual e o creme depilatório usando um tecido úmido, em seguida, limpe a perna com água estéril. Pulverizar 70% de etanol ao redor da perna para esterilizar a área de operação. Coloque o mouse em uma posição propensa e use fita cirúrgica para expor a área de operação na perna direita.
Injete intradermicamente cinco microliters de corante azul evans de 1%, ou nove centímetros do fluido do aparelho de injeção tubo no bloco do pé direito do mouse. Massageie suavemente o footpad para ajudar o fluido a entrar nos vasos linfáticos. Sob um microscópio dissecando, localize um local de incisão a cinco milímetros da borda inferior da fossa popliteal.
Usando uma tesoura, faça uma pequena incisão de aproximadamente cinco milímetros de comprimento. Em seguida, use fórceps de operação finas para esticar a incisão e expor os vasos linfáticos coletados. Identifique ambos os diferentes vasos linfáticos que levam aos linfonodos popliteais.
Utilizando um suporte de agulha, insira cautelosamente a agulha de sutura entre os vasos linfáticos diferentes e a artéria safena. Puxe suavemente a agulha ao redor dos vasos linfáticos diferentes. Puxe cuidadosamente a corda de sutura, deixando cerca de dois centímetros da corda de sutura para trás.
Use o suporte de agulha para ajudar a amarrar o nó de um cirurgião. Massageie suavemente a almofada do pé para garantir que nenhum corante azul Evans passe pelo local da sutura e corte a corda em excesso com uma tesoura. Suturar os outros vasos linfáticos diferentes, em seguida, fechar a incisão da pele com a mesma sutura que foi usada para os vasos linfáticos.
Para o controle falso, injete intradermicamente cinco microliters de corante azul 1%Evans na almofada do pé esquerdo, e massageie a almofada para os pés. Abra a pele com uma incisão e feche a ferida sem suturar o vaso. Ao monitorar o rato após a cirurgia, a perna direita deve apresentar edema, com o corante azul Evans se espalhando para a coxa, enquanto a perna de controle mostrará corante azul evans restrito à almofada do pé.
Imediatamente após a cirurgia, injete intradermicamente 10 microliters de 2%FITC tanto na almofada do pé direito quanto na esquerda. Duas, seis e 12 horas após a injeção fitc, colete os linfonodos popliteal da fossa de ratos eutanizados. Remova cuidadosamente o tecido adiposo perinodal ao redor das pLNs.
Incorpore as pLNs no composto de temperatura de corte ideal com a área do seio medular voltada para o lado do molde criogeno. Use um criotome para preparar seções congeladas de 20 mícrons. Para determinar a distribuição FITC nas pLNs, imagem as crio-seções sob um microscópio confocal.
Imagens confocal capturadas duas, seis e 12 horas após a injeção fitc mostram substancialmente reduzido o acúmulo fitc nos linfonodos popliteal depois de suturar os diferentes vasos linfáticos. O FITC residual nas pLNs foi preferencialmente acumulado nos seios linfáticos. Imagens confocal do tecido adiposo perinodal mostram quando os vasos linfáticos são bloqueados pela sutura, o FITC entra no tecido quando o linfonodo peca, mas não é efetivamente distribuído por todos os linfonodos.
Ao tentar este método, é importante lembrar que inserir a agulha de sutura entre o vaso sanguíneo e o vaso linfático é fundamental. O fracasso desta etapa pode quebrar os vasos. Depois de realizar este método, é possível imunizar camundongos com infecção ou outra estimulação imunológica para estudar como o fluxo linfático regula a proteção imunológica.
A função do fluxo linfático não é bem compreendida. Este método pode ser usado para estudar migrações celulares no linfonodo na ausência de fluxo linfático.
