אנחנו רוצים ליצור מודל שבץ שמייצר קריש דם שדומה לדגימות של מטופלים ומגיב לטיפול התרומבוליטי הרלוונטי מבחינה קלינית. לכן, אנו משנים את מודל השבץ הפוטוטרומבוטי הקלאסי וערבוב תרומבין והצבע הפוטודינמי ורד בנגל לפני הפוטואקטיבציה. אנו שמחים שהליך זה אכן יוצר קריש דם רגיש מאוד לפקקת בתיווך tPA.
מודל שבץ פוטוטרומבוטי שונה זה השתמש בהליכים כירורגיים פשוטים מאוד עם שיעור תמותה נמוך ויצר גודל אוטם עקבי מאוד ומיקום. אתה גם מייצר קריש דם מעורב פיברין וטסיות דם הדומים לאלה בחולה שבץ חריף. לכן, אנו חושבים שזה די שימושי עבור מחקר שבץ פרה-קליני לפתח טיפולים תרומבוליטיים יעילים יותר.
אנחנו מקווים שיותר אנשים ישתמשו במודל שלנו. מי שידגים את ההליך יהיה ד"ר יו-יו סון, עוזר המחקר שלנו בקבוצה שלנו. 30 דקות לפני הניתוח, להכין את העכבר על ידי הזרקת משכך כאבים.
לאחר הרדמת העכבר, בצע צביטת בוהן כדי לוודא שהוא מורדם לחלוטין. לאחר מכן להסיר את השיער על הצוואר השמאלי ואת הראש עם קרם להסרת שיער. הניחו את העכבר על מתאם בעלי החיים הקטן במצב שכיבה, ועיקרו את אזור העור הכירורגי על ידי ניגובו בשלוש החלקות לסירוגין של יוד פובידון ואתנול 70%.
תחת מיקרוסקופ מנתח, יש לבצע חתך צוואר הרחם השמאלי בקוטר 0.5 ס"מ באמצעות זוג מספריים זעירים ומלקחיים ישרים בגובה של כ-0.2 ס"מ לרוחב לקו האמצע. לאחר מכן, באמצעות זוג מלקחיים משוננים עדינים, לפרק את הרקמה הרכה ואת הפאשיה כדי לחשוף את LCCA. לאחר מכן באמצעות זוג מלקחיים חלקים עדינים, להפריד בזהירות את LCCA מן העצב vagal.
מניחים תפר קבוע של קשר כפול סביב LCCA באמצעות תפר משי 5-0. הפוך את העכבר למצב נוטה וסובב את גליל האטב לאף ב -15 מעלות. לאחר מכן לעקר את אזור הניתוח על ידי ניגוב העור עם שלוש החלקות לסירוגין של בטדין ו 70% אתנול.
בצע חתך של 0.8 ס"מ בקרקפת באמצעות זוג מספריים זעירים ומלקחיים ישרים לאורך עין שמאל ואוזן כדי לחשוף את שריר הרקה. לאחר מכן, בצע חתך של 0.5 ס"מ לאורך קצה שריר הטמפורליס בעצם הקודקוד השמאלית. לאחר מכן בצע חתך אנכי שני של 0.3 ס"מ בשריר הטמפורליס ומשוך את השריר כדי לחשוף את קצה העצם הקודקודית ועצם הקשקש.
הקפד לדמיין את ציון הדרך של התפר העטרה בין העצמות הקדמיות והקודקודיות. לאחר מכן, להרטיב את הגולגולת על ידי מריחת מלח סטרילי כדי לחשוף את MCA שמאל, ולסמן את ענף MCA פרוקסימלי על עצם הקשקש עם טוש. ציירו בעדינות עיגול בקוטר מילימטר אחד המקיף אזור מסומן זה באמצעות מקדחה פנאומטית לשיניים.
לאחר מכן מדללים את הגולגולת בעומק של כ-0.2 מילימטרים מבלי לגעת מתחת לדורה. הפסק את הקידוח כאשר נשארת שכבה דקה מאוד של עצם. לאחר מכן, מערבבים את תמיסת הטרומבין והוורד בנגל בהתבסס על משקל גופו של העכבר, ומזריקים את התערובת לאט לסינוס הרטרו-אורביטלי עם מחט של 31 מד.
יש למרוח משחת עיניים על שתי העיניים למניעת יובש. יש להחיל את התאורה עם אור לייזר 532 ננומטר על האתר שנקדח במרחק של שני אינץ 'למשך 20 דקות. דמיינו את התאורה בסניף הפרוקסימלי של ה-MCA באמצעות משקפי הקרנת לייזר.
לאחר 20 דקות, הפסק את תאורת הלייזר. צור חלון גולגולת בקוטר של שלושה מילימטרים על העצם הקודקודית של הגולגולת, ומניחים עליו זכוכית כיסוי. לאחר מכן אתרו את ה-MCA הדיסטלי מתחת לעדשה אובייקטיבית של טבילה במים פי 20.
יש לתייג את טסיות הדם במחזור הדם על ידי הזרקת ורידים בזנב של נוגדן DyLight 488 מצומד נגד GP1b-beta חמש דקות לפני ההדמיה. לאחר מכן להזריק רטרו את תערובת תרומבין וורד בנגל פתרון. הפעל את ה- MCA באמצעות מערכת לייזר של 532 ננומטר עם קרן לייזר בקוטר 10 מיקרומטר, והקלט את התמונה עד להיווצרות פקקת.
למתן tPA, הניחו את בעל החיים המרדים על פד חם של 37 מעלות צלזיוס. עטפו את זנבו בגזה חמה ורטובה של 45 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת בנקודת הזמן שלאחר הפוטואקטיבציה שנבחרה. לאחר מכן, להזריק את tPA האנושי רקומביננטי דרך וריד הזנב.
יש להזריק 50% כבולוס, ולהחדיר את 50% הנותרים במשך 30 דקות באמצעות משאבת עירוי. כדי לפקח על זרימת הדם במוח, בצע חתך בקו האמצע בקרקפת עם הגולגולת חשופה. לחות את הגולגולת עם מלוחים סטריליים, בעדינות להחיל את ג'ל אולטרסאונד על זה, הקפד למנוע שיער או בועות אוויר בג'ל.
עקוב אחר זרימת הדם המוחית בשתי ההמיספרות המוחיות מתחת לתמונת הניגוד של נקודות הלייזר במשך 10 דקות. תיוג אימונופלואורסנציה מראה כי בפוטוטרומבוזה המבוססת על צבע בנגלי ורד, ענף MCA היה עמוס בצפיפות בטסיות דם חיוביות CD41 ומעט פיברין. לעומת זאת, בפוטוטרומבוזה של תרומבין פלוס ורד בנגל, ענף MCA נחסם על ידי קרישי טסיות ופיברין מעורבבים באופן אקראי.
ניתוח האימונובלוטינג הראה עלייה גדולה מפי שניים בשקיעת פיברין בחצי הכדור האיפסילטרלי בטרומבין בתוספת פוטוטרומבוזה בנגלית של ורדים בהשוואה לבנגל ורדים בלבד. הדמיה תוך-חיונית המבוססת על מיקרוסקופ קונפוקלי הראתה כי הזרקת תרומבין תוך ורידי לא הצליחה לגרום לצברי טסיות, אפילו תחת תאורת לייזר. טסיות הדם יצרו קרישי דם הומוגניים במודל הפוטוטרומבוזיס הבנגלי הוורד, אך אגרגטים לא אחידים עם אזורים קלושים מרובים במודל תרומבין פלוס ורד בנגל.
ה- CBF של אותו עכבר לפני ו -24 שעות לאחר הטיפול ב- tPA לעומת טיפול ברכב נמדד על ידי הדמיית ניגודיות כתמי לייזר ונורמל לחצי הכדור הנגדי. בפוטוטרומבוזיס הבנגלי הוורד, הטיפול ב- tPA הוביל למגמה של התאוששות CBF, במיוחד באזור הגבול האיסכמי בהשוואה לעכברים שטופלו ברכב. בפוטוטרומבוזיס תרומבין פלוס ורד בנגל, ההתאוששות של CBF בעכברים שטופלו ב- tPA הייתה בולטת יותר, וענפי MCA הפרוקסימליים נראו לעתים קרובות לאחר 24 שעות.
בפוטוטרומבוזיס בנגלי ורדים, גודל אוטם דומה זוהה בעכברים שטופלו ברכב ובעכברים שטופלו ב-tPA. לעומת זאת, בפוטוטרומבוזה של טרומבין פלוס רוז בנגל, הטיפול הליטי ב-tPA הפחית משמעותית את האוטם ב-0.5, שעה או שעתיים, אך לא בשש שעות לאחר הפוטואקטיבציה בהשוואה לעכברים שטופלו ברכב, יצירת פיברין בתיווך טרומבין חיונית להיווצרות פקקת בהליך זה. שיטה זו יכולה לשמש כדי לחקור את הרכב קריש הדם כדי להמשיך לחקור טיפולים thrombolytic.
בעקבות הליך זה, שיטות אחרות של טיפול פקקת ניתן ליישם ואת היעילות מאוחר יותר נקבע. הוספת תרומבין מאפשרת להתאים את הרכב הקריש מעשיר בפיברין לעשיר בפיברין, ומאפשרת לחוקרים לפתח אסטרטגיות טיפוליות רלוונטיות מבחינה קלינית.
